發(fā)布時間：2020-11-14 16:10

　　 【目的】闡明霍亂弧菌ToxR蛋白功能調(diào)控的分子機制�！痉椒ā坷�用巰基捕獲(thiol-trapping)的方法分析DsbA蛋白對ToxR周質(zhì)空間結(jié)構(gòu)域半胱氨酸殘基的氧化作用;采用定點突變的方法構(gòu)建ToxR半胱氨酸突變株(ToxR_(C236/293S));利用熒光素酶基因作為報告基因分析ToxR野生型(ToxR_(wt))和半胱氨酸突變體(ToxR_(C236/293S))誘導(dǎo)下游基因表達的活性;通過細菌雙雜交系統(tǒng)分析ToxR_(wt)和ToxR_(C236/293S)蛋白之間、ToxR與ToxS之間以及ToxS之間的相互作用。【結(jié)果】ToxR周質(zhì)空間結(jié)構(gòu)域半胱氨酸殘基確實可以被DsbA蛋白氧化,且當(dāng)ToxR與ToxS共表達時,ToxR誘導(dǎo)ctxAB轉(zhuǎn)錄表達的活性顯著增強,且在dsbA基因缺失突變株中ToxR誘導(dǎo)ctxAB轉(zhuǎn)錄表達的活性更高;成功構(gòu)建株霍亂弧菌ToxR半胱氨酸突變株(ToxR_(C236/293S)),在沒有ToxS存在的條件下,ToxR_(C236/293S)誘導(dǎo)毒力基因表達的活性與ToxRwt相當(dāng);細菌雙雜交系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)ToxR與ToxS共轉(zhuǎn)錄表達時,ToxS極大增強ToxR蛋白之間的互作;在dsbA基因缺失突變株中,ToxS之間的相互作用顯著增強。【結(jié)論】ToxR蛋白本身的氧還狀態(tài)對其誘導(dǎo)毒力基因表達的活性沒有影響;ToxS通過增強ToxR形成二聚體的能力從而增強其誘導(dǎo)毒力基因的表達,而DsbA對ToxS蛋白之間的相互作用具有抑制作用,DsbA通過影響ToxS的蛋白互作從而影響ToxR蛋白的功能。本文為進一步闡明霍亂弧菌毒力基因表達調(diào)控的分子機制提供重要的理論依據(jù)。
【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件:
        1.1.2 主要試劑:
    1.2 ToxR蛋白的氧還狀態(tài)分析
    1.3 熒光素酶報告基因表達分析
    1.4 細菌雙雜交系統(tǒng)驗證ToxR蛋白之間的相互作用
2 結(jié)果和分析
    2.1 霍亂弧菌ToxR蛋白可以被DsbA氧化
    2.2 DsbA對ToxR蛋白功能的影響
    2.3 ToxRC236/293S誘導(dǎo)下游基因表達的功能分析
    2.4 ToxR與ToxS蛋白之間的相互作用
3 討論

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