發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 11:54

　　 背景：系膜細(xì)胞（MC）的增殖、肥大及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分泌過(guò)多是糖尿病腎�。―N）發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）在DN基質(zhì)形成中起了重要作用。采取相應(yīng)措施抑制TGF-β表達(dá)，減少基質(zhì)的生成，有助于延緩病變的發(fā)生發(fā)展。多年來(lái)，人們一直進(jìn)行著關(guān)于DN最佳治療方案的探索。近年在DN大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)：大豆蛋白替代動(dòng)物蛋白能減輕DN動(dòng)物腎臟高濾過(guò)和蛋白尿的程度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的這些有益作用可能與其中所含的多酚類混合物（大豆異黃酮）有關(guān)。金雀異黃素是大豆異黃酮的主要活性成分，有多種生理功能，如調(diào)節(jié)雌激素受體、抗氧化作用、抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性等。研究認(rèn)為金雀異黃素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可能與其本身濃度和雌激素受體相關(guān)。又有文獻(xiàn)報(bào)道金雀異黃素可抑制腎小球MC Ⅳ型膠原的合成，減少ECM的聚積，可延緩腎小球疾病的進(jìn)展。非腎研究顯示金雀異黃素可抑制TGF-β的活性。目前關(guān)于金雀異黃素對(duì)DN影響的研究鮮有報(bào)道，但許多間接證據(jù)提示它對(duì)DN可能具有良好的治療作用。 目的：為了研究金雀異黃素對(duì)高糖培養(yǎng)下大鼠MC生長(zhǎng)及ECM分泌的影響，我們通過(guò)觀察不同濃度的金雀異黃素對(duì)高糖培養(yǎng)下大鼠MC增殖、凋亡的影響，初步探討其影響細(xì)胞生長(zhǎng)的可能機(jī)制，如高糖環(huán)境下NF-κB活性變化及金雀異黃素作用后活性的改變，以及細(xì)胞上雌激素受體的分布；同時(shí)了解金雀異黃素對(duì)ECM合成、TGF-β分泌及TGF-βmRNA表達(dá)的影響。為明確金雀異黃素在腎臟疾病治療中的地位及意義提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)體外培養(yǎng)的大鼠MC進(jìn)行研究。設(shè)立低糖對(duì)照組（葡萄糖濃度100mg/dl，不加金雀異黃素）和高糖實(shí)驗(yàn)組（葡萄糖濃度450mg/dl＋0、1、5、10、30、50μmol·L-1金雀異黃素），分別培養(yǎng)12、24、36、48小時(shí)。MTT法檢測(cè)不同金雀異黃素濃度作用下大鼠MC的OD值，描繪生長(zhǎng)曲線。DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞儀、HE染色和TUNEL末端標(biāo)記法四種方法檢測(cè)細(xì) WP=8 胞凋亡情況，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡指數(shù)（AI）。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、TGF-β的分泌情況，RT-PCR法檢測(cè)金雀異黃素對(duì)TGF-βmRNA表達(dá)的影響，明確量效關(guān)系。綠色熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠MC，按最佳轉(zhuǎn)染條件將NF-κB報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠MC，熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)低糖和高糖環(huán)境下NF-κB的活性，及加入不同濃度金雀異黃素后NF-κB的活性變化，免疫組化法檢測(cè)大鼠MC上雌激素α、β受體的分布。 結(jié)果： MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)48小時(shí)內(nèi)，高糖（0μmol·L-1）可刺激MC的增殖（與對(duì)照組相比p0.05），低濃度金雀異黃素（1μmol·L-1）抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用不顯著，5μmol·L-1組細(xì)胞生長(zhǎng)受到較輕的抑制作用，高濃度金雀異黃素（5μmol·L-1）可明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且同一濃度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率升高。DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示：作用24小時(shí)，對(duì)照組、0μmol·L-1組、1μmol·L-1組表現(xiàn)為基因組DNA，5μmol·L-1組出現(xiàn)模糊不清的條帶，提示已有凋亡的存在，高濃度組（10μmol·L-1、30μmol·L-1、50μmol·L-1）呈現(xiàn)明顯的梯形條帶。流式細(xì)胞儀證實(shí)高濃度金雀異黃素能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，且存在時(shí)間依賴和劑量依賴效應(yīng)，凋亡圖象出現(xiàn)亞二倍體峰。HE染色顯示10μmol·L-1作用大鼠系膜細(xì)胞12小時(shí)，大部分細(xì)胞形態(tài)正常，但細(xì)胞貼壁功能稍有下降；作用24小時(shí)，部分細(xì)胞脫落，變小變圓，少量細(xì)胞胞漿空泡形成、染色體濃縮；作用36小時(shí)，部分細(xì)胞染色體濃縮，胞核固縮；作用48小時(shí)，大部分細(xì)胞核膜破裂，核固縮，胞漿空泡化。TUNEL末端標(biāo)記法顯示金雀異黃素作用24小時(shí)，對(duì)照組、0μmol·L-1組、1μmol·L-1組基本無(wú)棕染棕黃色顆粒出現(xiàn)，5μmol·L-1組少量出現(xiàn)，而高濃度組則出現(xiàn)較多的棕染棕黃色顆粒。ELISA法顯示高糖能促進(jìn)細(xì)胞合成Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白及分泌TGF-β，具有時(shí)間依賴和劑量依賴效應(yīng)。10μmol·L-1組、30μmol·L-1組、50μmol·L-1組能明顯抑制ECM的合成與TGF-β的分泌。RT-PCR法顯示高濃度金雀異黃素可抑制TGF-βmRNA的表達(dá)。綠色熒光蛋白0.2μg與脂質(zhì)體1.8μg結(jié)合時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，按此條件將NF-κB報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞，經(jīng)熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在高糖條件下NF-κB活性較低糖增高，加入金雀異黃素后NF-κB活性受 WP=9 到抑制，且金雀異黃素濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。免疫組化方法提示大鼠MC上以雌激素β受體分布為主，幾乎沒(méi)有α受體的表達(dá)。 結(jié)論：在體外高糖條件下，大鼠MC在48小時(shí)內(nèi)以增殖為主。一定濃度的金雀異黃素（5μmol·L-1）可促進(jìn)大鼠MC的凋亡、抑制其增殖，并減少ECM的合成。金雀異黃素可在蛋白和基因水平抑制TGF-β的分泌，具有時(shí)間依賴、劑量依賴效應(yīng)。在高糖作用下，NF-κB活性增高，金雀異黃素可抑制高糖引起的NF-κB的活性增高；大鼠MC上雌激素受體分布以β受體為主，我們初步認(rèn)為金雀異黃素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可能與抑制NF-κB的活性有關(guān)，與雌激素受體的關(guān)系尚難明確。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
英文縮寫(xiě)
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 金雀異黃素對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖及凋亡的影響
    一、 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
    二、 方法
    三、 結(jié)果
        （一） MTT法測(cè)定金雀異黃素對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響
        （二） 金雀異黃素對(duì)大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響
            1. DNA電泳
            2. 流式細(xì)胞儀
            3. HE染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡
            4. TUNEL末端標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
    四、 討論
第二部分 金雀異黃素對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及TGF-β分泌的影響
    一、 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
    二、 方法
    三、 結(jié)果
        （一） ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清Ⅳ型膠原含量
        （二） ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清纖連蛋白含量
        （三） ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清TGF-β含量
        （四） RT-PCR法檢測(cè)TGF-βmRNA的表達(dá)
    四、 討論
第三部分 金雀異黃素對(duì)大鼠系膜細(xì)胞生長(zhǎng)影響的可能機(jī)制
    一、 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑
    二、 方法
    三、 結(jié)果
        （一） 綠色熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞
        （二） 檢測(cè)NF-κB在高糖作用下的活性變化
        （三） 檢測(cè)NF-κB在金雀異黃素作用下的活性變化
        （四） 大鼠系膜細(xì)胞雌激素α、β受體檢測(cè)
四、 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
課題綜述
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致謝

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1 鄭駿年;細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè));1999年03期

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