胚胎干細(xì)胞是從哺乳類動物的囊胚內(nèi)細(xì)胞群或原始生殖嵴細(xì)胞分離、 體外培養(yǎng)（抑制其分化）獲得的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。ES細(xì)胞是研究哺 乳動物胚胎早期發(fā)生、細(xì)胞分化、基因調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)基本問題的理想 模型，也是組織工程、藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的重要工具。昆明小鼠是我 國最常用的實驗小鼠。建立昆明小鼠的ES細(xì)胞系有利于其轉(zhuǎn)基因動物的 獲得，能夠為我國的科研工作更好的服務(wù)。胚胎干細(xì)胞神經(jīng)定向分化能夠 有效地修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。由此可見，分離昆明小鼠的胚胎干細(xì)胞， 掌握其生物學(xué)特性，并了解胚胎干細(xì)胞神經(jīng)定向分化機(jī)制是完全有必要的。 本實驗利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，收集昆明小鼠孕3.5d的囊 胚進(jìn)行培養(yǎng)，采用二次亞克隆法篩選純化ES細(xì)胞集落，使其穩(wěn)定傳代后對 其生物學(xué)性狀進(jìn)行初步鑒定；4-/4+法利用維甲酸、雌激素及它們聯(lián)合誘導(dǎo) MESPU35胚胎干細(xì)胞系體外分化，免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)和流式細(xì) 胞儀對分化細(xì)胞進(jìn)行分析，研究上述誘導(dǎo)劑對MESPU35細(xì)胞系神經(jīng)定向 分化的誘導(dǎo)作用，為進(jìn)一步進(jìn)行移植學(xué)實踐打下基礎(chǔ)。 結(jié)果： 1．培養(yǎng)了95個昆明小鼠囊胚，13例內(nèi)細(xì)胞群離散后出現(xiàn)了胚胎干細(xì) 胞樣集落，這些集落經(jīng)過兩次亞克隆純化后，獲得兩個昆明小鼠胚胎干細(xì)胞 株，即KMMES1和KMMES2。 2．KMMES1和KMMES2細(xì)胞株具有典型的胚胎干細(xì)胞形態(tài)，AKP 染色強(qiáng)陽性和全能性；然而兩個細(xì)胞株生長速度、體外分化能力和正常核 型比例等生物學(xué)性狀存在一定的差異。 3．相差顯微鏡觀察RA誘導(dǎo)MESPU35細(xì)胞系形成神經(jīng)樣細(xì)胞擬胚體 百分率隨分化時相點和RA濃度升高而升高，與對照組相差顯著；雌激素 誘導(dǎo)組與對照組無顯著差別：RA聯(lián)合雌激素誘導(dǎo)組與對照組差別顯著， 然而和RA誘導(dǎo)組差別不顯著。 4．免疫細(xì)胞化學(xué)觀察RA誘導(dǎo)MESPU35細(xì)胞系分化形成的NF200陽 性細(xì)胞和 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)隨分化時相點和 RA濃度升高而升高；NF200 陽性細(xì)胞形態(tài)由無突起變?yōu)槎鄻O細(xì)胞，GFAP陽性細(xì)胞突起由短變長，最 后聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀；分化過程中未見Gale染色陽性細(xì)胞出現(xiàn)。 5．免疫細(xì)胞化學(xué)觀察RA聯(lián)合雌激素誘導(dǎo)MESPU35細(xì)胞系分化形成 的NF200陽性細(xì)胞和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)隨分化時相點和RA濃度升高而升 高；NF200陽性細(xì)胞形態(tài)多為雙極細(xì)胞，GFAP陽性細(xì)胞形成的突起細(xì)長， 兩者與 RA誘導(dǎo)組比較細(xì)胞體積較��；分化過程中未見 GalC染色陽性細(xì)胞 出現(xiàn)。 6．流式細(xì)胞儀檢測RA誘導(dǎo)MESPU35細(xì)胞系分化形成的NF200陽性 細(xì)胞和 GFAP陽性細(xì)胞的比例，GFAP陽性細(xì)胞和 NF200陽性細(xì)胞數(shù)隨分 化時相點和 RA濃度升高而升高，與自然分化 14天的細(xì)胞比較相差顯著。 結(jié)論： 1．我們成功分離了昆明小鼠 ES細(xì)胞株，KMME SI和 KMMESZ，通過 觀察昆明小鼠ES細(xì)胞的生物學(xué)性狀，為轉(zhuǎn)基因動物的建立打下基礎(chǔ)。 2．RA是有效的ES細(xì)胞神經(jīng)定向分化誘導(dǎo)劑，對MESPU35細(xì)胞系神 經(jīng)定向分化的調(diào)節(jié)以濃度和時間依賴模式進(jìn)行。ES細(xì)胞神經(jīng)定向分化是研 究神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的體外模型。 3．雌激素聯(lián)合RA誘導(dǎo)后產(chǎn)生的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有一定變化，提示可 能雌激素激活某些調(diào)控神經(jīng)分化的基因表達(dá)，改變神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的一般過 程。 4．Gal．c染色始終無陽性細(xì)胞出現(xiàn)，此結(jié)果可能提示MESPU35細(xì)胞 系缺乏生成少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，也可能由于Gal－c是成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞 的標(biāo)志物，而誘導(dǎo)分化時間還不夠長。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類】：R329.2
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英文摘要
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論文正文 小鼠胚胎干細(xì)胞的分離、鑒定和神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化
    前 言
    第一部分 昆明種系小鼠胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及特性鑒定
    第二部分 胚胎干細(xì)胞神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化實驗
參考文獻(xiàn)
致 謝
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文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 洪俊君;小鼠ES細(xì)胞飼養(yǎng)層制備與ES細(xì)胞EGFP瞬時轉(zhuǎn)染效率的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號：2882934