發(fā)布時間：2020-11-14 02:06

　　 胚胎干細胞是從哺乳類動物的囊胚內(nèi)細胞群或原始生殖嵴細胞分離、 體外培養(yǎng)（抑制其分化）獲得的具有發(fā)育全能性的細胞。ES細胞是研究哺 乳動物胚胎早期發(fā)生、細胞分化、基因調(diào)控等發(fā)育生物學基本問題的理想 模型，也是組織工程、藥理學和臨床醫(yī)學研究的重要工具。昆明小鼠是我 國最常用的實驗小鼠。建立昆明小鼠的ES細胞系有利于其轉(zhuǎn)基因動物的 獲得，能夠為我國的科研工作更好的服務。胚胎干細胞神經(jīng)定向分化能夠 有效地修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。由此可見，分離昆明小鼠的胚胎干細胞， 掌握其生物學特性，并了解胚胎干細胞神經(jīng)定向分化機制是完全有必要的。 本實驗利用小鼠胚胎成纖維細胞為飼養(yǎng)層，收集昆明小鼠孕3.5d的囊 胚進行培養(yǎng)，采用二次亞克隆法篩選純化ES細胞集落，使其穩(wěn)定傳代后對 其生物學性狀進行初步鑒定；4-/4+法利用維甲酸、雌激素及它們聯(lián)合誘導 MESPU35胚胎干細胞系體外分化，免疫細胞化學、免疫熒光雙標和流式細 胞儀對分化細胞進行分析，研究上述誘導劑對MESPU35細胞系神經(jīng)定向 分化的誘導作用，為進一步進行移植學實踐打下基礎。 結(jié)果： 1．培養(yǎng)了95個昆明小鼠囊胚，13例內(nèi)細胞群離散后出現(xiàn)了胚胎干細 胞樣集落，這些集落經(jīng)過兩次亞克隆純化后，獲得兩個昆明小鼠胚胎干細胞 株，即KMMES1和KMMES2。 2．KMMES1和KMMES2細胞株具有典型的胚胎干細胞形態(tài)，AKP 染色強陽性和全能性；然而兩個細胞株生長速度、體外分化能力和正常核 型比例等生物學性狀存在一定的差異。 3．相差顯微鏡觀察RA誘導MESPU35細胞系形成神經(jīng)樣細胞擬胚體 百分率隨分化時相點和RA濃度升高而升高，與對照組相差顯著；雌激素 誘導組與對照組無顯著差別：RA聯(lián)合雌激素誘導組與對照組差別顯著， 然而和RA誘導組差別不顯著。 4．免疫細胞化學觀察RA誘導MESPU35細胞系分化形成的NF200陽 性細胞和 GFAP陽性細胞數(shù)隨分化時相點和 RA濃度升高而升高；NF200 陽性細胞形態(tài)由無突起變?yōu)槎鄻O細胞，GFAP陽性細胞突起由短變長，最 后聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀；分化過程中未見Gale染色陽性細胞出現(xiàn)。 5．免疫細胞化學觀察RA聯(lián)合雌激素誘導MESPU35細胞系分化形成 的NF200陽性細胞和GFAP陽性細胞數(shù)隨分化時相點和RA濃度升高而升 高；NF200陽性細胞形態(tài)多為雙極細胞，GFAP陽性細胞形成的突起細長， 兩者與 RA誘導組比較細胞體積較��；分化過程中未見 GalC染色陽性細胞 出現(xiàn)。 6．流式細胞儀檢測RA誘導MESPU35細胞系分化形成的NF200陽性 細胞和 GFAP陽性細胞的比例，GFAP陽性細胞和 NF200陽性細胞數(shù)隨分 化時相點和 RA濃度升高而升高，與自然分化 14天的細胞比較相差顯著。 結(jié)論： 1．我們成功分離了昆明小鼠 ES細胞株，KMME SI和 KMMESZ，通過 觀察昆明小鼠ES細胞的生物學性狀，為轉(zhuǎn)基因動物的建立打下基礎。 2．RA是有效的ES細胞神經(jīng)定向分化誘導劑，對MESPU35細胞系神 經(jīng)定向分化的調(diào)節(jié)以濃度和時間依賴模式進行。ES細胞神經(jīng)定向分化是研 究神經(jīng)細胞發(fā)育的體外模型。 3．雌激素聯(lián)合RA誘導后產(chǎn)生的細胞在形態(tài)學上有一定變化，提示可 能雌激素激活某些調(diào)控神經(jīng)分化的基因表達，改變神經(jīng)細胞發(fā)育的一般過 程。 4．Gal．c染色始終無陽性細胞出現(xiàn)，此結(jié)果可能提示MESPU35細胞 系缺乏生成少突膠質(zhì)細胞的能力，也可能由于Gal－c是成熟少突膠質(zhì)細胞 的標志物，而誘導分化時間還不夠長。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2001
【中圖分類】：R329.2
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英文摘要
中文摘要
論文正文 小鼠胚胎干細胞的分離、鑒定和神經(jīng)定向誘導分化
    前 言
    第一部分 昆明種系小鼠胚胎干細胞的分離、培養(yǎng)及特性鑒定
    第二部分 胚胎干細胞神經(jīng)定向誘導分化實驗
參考文獻
致 謝
照 片
文獻綜述
    參考文獻

【引證文獻】

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1 洪俊君;小鼠ES細胞飼養(yǎng)層制備與ES細胞EGFP瞬時轉(zhuǎn)染效率的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2007年

本文編號：2882934