發(fā)布時間：2018-02-27 14:52

  本文關(guān)鍵詞： E2F3 Trizol PCR 克隆 表達(dá) Western blot　出處：《西北大學(xué)》2005年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:E2F轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞周期中G1期進(jìn)入S期的重要調(diào)控因子。同時,E2F因子與腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞凋亡有著緊密的關(guān)系。為了研究人E2F3(E2F家族成員)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能,了解其與腫瘤發(fā)生的聯(lián)系,從人組織中克隆E2F3基因,構(gòu)建其原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體,實現(xiàn)其原核表達(dá)和真核表達(dá),從而為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。 方法:通過Trizol法抽提人肝癌細(xì)胞的總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以cDNA為模板通過巢式PCR和橋聯(lián)PCR的方法克隆E2F3基因,構(gòu)建了四種E2F3基因的原核表達(dá)載體pET28a-E2F3、pET32a-E2F3、pQE30-E2F3和pGEX-4T-E2F3和一種真核表達(dá)載體pEGFP-N1-E2F3。原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21工程菌進(jìn)行誘導(dǎo),用Western blot檢測重組蛋白。真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞觀察克隆的E2F3基因在真核細(xì)胞中有無表達(dá)活性。 結(jié)果:成功克隆出E2F3全長基因,通過更換不同的表達(dá)載體實現(xiàn)了對E2F3基因的原核表達(dá)并且對表達(dá)的重組蛋白用Western方法進(jìn)行了檢測。另外還構(gòu)建了E2F3基因的真核表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞表明構(gòu)建的E2F3真核表達(dá)載體具有表達(dá)活性,這為以后的細(xì)胞學(xué)實驗做好了前期的準(zhǔn)備。 結(jié)論:E2F3基因近5’端一段富含GC的序列會嚴(yán)重影響E2F3基因的PCR擴(kuò)增,我們推測這段序列可能是E2F3基因的一個內(nèi)部調(diào)控區(qū),它可能會通過形成二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)來調(diào)控E2F3基因的表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)E2F3基因在不同的原核表達(dá)載體中存在表達(dá)差異,融合有GST的E2F3基因較易實現(xiàn)原核表達(dá),這可能是因為表達(dá)載體功能元件的差異和E2F3基因本身的一些特點(diǎn)所致。
[Abstract]:Objective : E2F transcription factor is an important regulator of cell cycle G1 phase to enter S phase . In order to study the structure and function of the transcription factor of E2F3 ( E2F family member ) and to understand its association with tumor , the E2F3 gene is cloned from human tissue , its prokaryotic expression vector and eukaryotic expression vector are constructed , and its prokaryotic expression and eukaryotic expression vector are constructed , thus laying the foundation for further research .








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本文編號：1543132