發(fā)布時間：2017-12-22 18:02

  本文關鍵詞：重組質(zhì)粒pSMART2b-Rhomboid3的構建及抗柔嫩艾美耳球蟲的初步應用　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 柔嫩艾美耳球蟲 Rhomboid3 重組質(zhì)粒 免疫保護

【摘要】：雞球蟲病是由艾美耳屬(Eimeria)的球蟲寄生于雞腸道引起的一種寄生性原蟲病,尤以柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的致病力最強,故成為本病防治的重點。由于該病嚴重影響雞體的生長發(fā)育、產(chǎn)蛋率等,對養(yǎng)雞業(yè)的危害巨大,據(jù)相關統(tǒng)計,每年給全世界造成的經(jīng)濟損失達30多億美元。然而,目前防治該病主要依靠藥物和活球蟲疫苗,但長期使用藥物防治球蟲病會導致耐藥蟲株以及藥物殘留等問題,且活疫苗存在散毒、毒力反祖等問題。故研制出一種免疫效果好、使用安全的疫苗用于預防和控制雞球蟲病是有必要。本研究以柔嫩艾美耳球蟲的Rhomboid3基因作為抗原分子,用真核表達載體pSMART2b傳遞和表達該抗原分子,并將該重組質(zhì)粒導入293細胞中進行表達,然后將重組質(zhì)粒免疫雞只,檢測其引起雞體的細胞免疫及體液免疫情況,最后通過攻蟲試驗,計算抗球蟲指數(shù)(ACI)來綜合評價重組質(zhì)粒pSMARAT2b-Rhomboid3對雞群球蟲病的保護效果,以此來初步探索其成為球蟲疫苗的潛力。重組質(zhì)粒pSMARAT2b-Rhomboid3的構建及表達提取柔嫩艾美耳球蟲的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為c DNA,通過PCR擴增Rhomboid3基因,然后連接p MD-18T、pSMARAT2b并在DH5α中克隆,且通過測序及酶切鑒定,大小為774bp。接著將重組質(zhì)粒pSMARAT2b-Rhomboid3通過LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)入293細胞表達,并用雞抗柔嫩艾美耳球蟲的陽性血清做Western blot分析,證明Rhomboid3蛋白具有反應原性。重組質(zhì)粒pSMARAT2b-Rhomboid3誘導雞體的免疫應答將構建的重組質(zhì)粒pSMARAT2b-Rhomboid3和空載體pSMARAT2b分別用50μg和100μg的劑量經(jīng)腿部肌肉免疫注射雞只,每次間隔1周共免疫3次,然后對抗體水平、細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)水平、T淋巴細胞增殖情況及毒性T淋巴細胞活性進行測定。結果表明,免疫劑量50μg和免疫劑量100μg組的抗體水平、IL-2、IFN-γ、T淋巴細胞增殖及毒性T淋巴細胞活性都有明顯升高(P0.01),免疫劑量100μg組比免疫劑量50μg組的高,且兩個免疫組與對照組相比,差異極顯著(P0.01)。重組質(zhì)粒pSMARAT2b-Rhomboid3抗柔嫩艾美耳球蟲保護效果通過重組質(zhì)粒pSMARAT2b-Rhomboid3經(jīng)三次免疫雞只后,進行攻蟲試驗,結果表明免疫重組質(zhì)粒50μg和100μg劑量組的與紅對照組相比,卵囊數(shù)明顯減少,體重增加,盲腸病變減少,且差異顯著(P0.05)。經(jīng)過綜合評價免疫劑量50μg組和免疫劑量100μg組的ACI分別為181.25和184.22,均顯示出較好的保護效果。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.31

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本文編號：1320450