發(fā)布時間：2017-01-01 00:06

  本文關鍵詞：MAPK家族在成骨細胞分化過程中調控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《蘭州大學》 2015年

MAPK家族在成骨細胞分化過程中調控作用的研究

趙良功  

【摘要】：目的：隨著老齡化社會的到來,骨質疏松成為世界廣泛關注的健康問題之一,是絕經(jīng)后女性和老年人的常見病。針對骨質疏松合理的治療方案包含藥物治療與運動治療相結合。但由于應力在成骨過程中作用機制不甚明確,臨床醫(yī)生很難指導患者進行正確地運動治療。同時,現(xiàn)有藥物在治療骨質疏松的同時還存在增加乳腺癌和子宮內膜癌等患病率的副作用。探索并發(fā)現(xiàn)促成骨效率高而副作用小或無副作用的骨質疏松治療藥物非常重要。本論文通過分別研究MAPK家族成員ERK5在流體剪切力促進成骨細胞分化及p38 MAPK在紅芪多糖促進成骨過程中不同的調控作用,為臨床正確指導患者進行合理運動及成骨減少性疾病治療藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。方法：第一部分：對MC3T3-E1成骨細胞加載間歇流體剪切力或間歇性流體剪切力,應用MEK5/ERK5特異性阻斷劑BIX02189抑制ERK5的活性,研究比較兩種流體剪切力對成骨細胞分化促進作用的強弱以及ERK5在間歇性流體剪切力促進成骨細胞分化過程中的調控作用；第二部分：水提醇沉淀法從中藥材紅芪中分離得到不同分子量范圍的紅芪多糖(HPS),進一步純化得到HPS3d。通過對成骨細胞給予不同濃度HPS3d刺激72小時,并且應用p38 MAPK特異性阻斷劑SB203580抑制p38的活性,通過MTT、RT-PCR和Westernblot等方法研究HPS3d促進成骨細胞分化和P38 MAPK對上述過程的調控作用。結果：第一部分：(1)同對照組相比,持續(xù)性與間歇性流體剪切力均可以促進ERK5的磷酸化,增強ALP的活性,促進OCN及OPN的蛋白表達。進一步比較發(fā)現(xiàn),加載間歇性流體剪切力的成骨細胞中,ERK5磷酸化水平、ALP的活性OCN、 OPN的蛋白表達量均明顯高于加載持續(xù)性流體剪切力的成骨細胞。(2)加載間歇性流體剪切力后,成骨細胞中ERK5的磷酸化水平較正常組明顯升高,而應用10μM的MEK5/ERK5阻斷劑BIX02189孵育2小時后,MEK5/ERK5的活性完全受到抑制。同對照組相比,間歇性流體剪切力可以增強成骨細胞中ALP的活性,增加OPN、OCN和Runx-2的表達。但抑制MEK5/ERK5的活性后,這種促進作用也相應的受到減弱。同時,單獨應用BIX02189對ALP的活性,OPN, OCN和Runx-2的表達無明顯影響(p0.05)。第二部分：(1)通過對紅芪藥材進行提取、分離和純化,從中獲得了組成均一的紅芪多糖HPS3d。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),HPS3d中多糖含量為94.35%,蛋白質含量為3.4%,糖醛酸含量為13.3%,HPS3d為酸性糖蛋白復合物。元素分析結果O為53.91%,C為38.18%,H為5.66%,S為1.73%,N為0.52%。HPS3d的分子量范圍為84.6kDa,空間分子構象為高枝化度結構。結構中含有鼠李糖(5.93%)、阿拉伯糖(39.95%)、葡萄糖(6.76%)、半乳糖(39.95%)及半乳糖醛酸(8.05%)。HPS3d的支鏈主要由阿拉伯糖構成,而主鏈由半乳糖與半乳糖醛酸構成。(2)成骨細胞分別經(jīng)過濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml、 8.0mg/ml、16.0mg/ml及32mg/ml的HPS3d刺激72h后,用MTT法檢測細胞活性。結果可見,當HPS3d濃度為0.5-8.0mg/ml時,細胞活性同對照組相比無顯著性差異(P0.05)。(3)成骨細胞分別經(jīng)過濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml和8.0mg/ml的HPS3d刺激72h后發(fā)現(xiàn),當HPS3d濃度為0.5mg/ml時,ALP活性,OPN、OCN和BSP的]mnRNA表達未受到明顯影響。當HPS3d濃度為1.0mg/ml、 2.0mg/ml和4.0mg/ml時,ALP活性,OPN、OCN和BSP的mRNA表達呈濃度依賴性升高。并且當HPS3d濃度為8.0mg/ml時,ALP活性,OPN、OCN和BSP的mRNA表達同4.0mg/ml組比較不再繼續(xù)升高(P0.05)。(4)用濃度為0.5-8.0mg/ml的HPS3d刺激成骨細胞胞72h后,Runx-2和Osterix的mRNA表達量自HPS3d濃度為1.0mg/ml時開始呈劑量依賴性升高,并在4.0mg/ml時達到最高,同對照組相比,分別升高了5.2倍和6.6倍。進一步用濃度為2.0mg/ml和4.0mg/mlHPS3d刺激成骨細胞72小時后,Western blot檢測Runx-2和Osterix蛋白表達量均明顯升高。(5)用濃度為0.5-8.0mg/ml的HPS3d刺激成骨細胞胞72h后,BMP-2的mRNA表達量自HPS3d濃度為1.0mg/ml時開始呈劑量依賴性升高,并在4.0mg/ml時達到最高。進一步用濃度為2.0mg/mI和4.0mg/mIHPS3d刺激成骨細胞72小時后,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SMAD1/5/8的磷酸化水平較對照組升高。(6)用p38特異性阻斷劑SB203580預處理成骨細胞后再經(jīng)過4.0mg/ml HPS3d刺激72小時后,同對照組相比,經(jīng)HPS3d單獨刺激的成骨細胞中p38MAPK的磷酸化水平升高。p38 MAPK的特異性阻斷劑可以抑制上述HPS3d介導的p38 MAPK磷酸化。而HPS3d促進的ALP活性增強、OCN、OPN、BSP、 Runx-2和Osterix的mRNA表達升高在用SB203580后均受到不同程度的抑制。結論1、強度為12dyn/cm2的持續(xù)性與間歇性流體剪切力均可以促進MC3T3-E1成骨細胞ERK5的磷酸化,增強ALP的活性,促進OCN及OPN的蛋白表達。進而促進成骨細胞分化。同持續(xù)性流體剪切相比,間歇性流體剪切力是一種更為有效的成骨細胞分化促進應力形式。2、抑制MEK5/ERK5的活性后,間歇性流體剪切力促進的成骨細胞中ALP的活性與OPN、OCN表達增加均受到抑制。MEK5/ERK5對流體剪切力促進成骨細胞分化具有調控作用。而成骨細胞分化關鍵性調控因子Runx-2的表達同時降低,說明除了ERKl/2與p38外,Runx-2的表達還受到MEK5/ERK5的調控。3、最終獲得的紅芪多糖的主要部分HPS3d為白色絮狀物,極易溶于水,為酸性糖蛋白復合物。元素含量O為53.91%,C為38.18%,H為5.66%,S為1.73%,N為0.52%。分子量范圍為84.6kDa,分子結構為高枝化度；支鏈主要由阿拉伯糖構成,而主鏈由半乳糖與半乳糖醛酸構成。4、適當濃度的HPS3d可以促進ALP活性,使OPN、OCN和BSP的mRNA表達并且呈濃度依賴性升高,進而促進成骨細胞分化；同時HPS3d使BMP-2、SMAD1/5/8、Runx-2和Osterix蛋白和mRNA的表達均升高。說明在HPS3d促進成骨細胞分化的過程中BMP-2/SMAD/Runx-2/Osterix信號通路被激活。同時中低濃度HPS3d對細胞無明顯毒性作用。5、HPS3d還可以激活p38 MAPK,在p38的活性受到特異性阻斷劑的抑制后,成骨細胞分化相關的多種蛋白表達及Runx-2和Osteri的表達均明顯受到抑制,說明p38 MAPK通過Runx-2/Osterix發(fā)揮調控HPS3d促進成骨細胞分化的作用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

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本文編號：230325