煙曲霉是自然界廣泛存在的真菌,可以引起免疫功能低下患者的嚴(yán)重機(jī)會(huì)感染。近20年來,隨著造血干細(xì)胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation,HSCT)技術(shù)的快速發(fā)展,造血干細(xì)胞移植的患者越來越多,而造血干細(xì)胞移植患者伴隨感染的機(jī)會(huì)也明顯增高。惡性腫瘤、粒細(xì)胞減少或功能障礙、糖皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑的使用等原因造成的患者免疫功能缺陷,導(dǎo)致侵襲性曲霉病發(fā)病率不斷上升。目前造血干細(xì)胞移植患者免疫功能抑制而感染侵襲性曲霉病是造血干細(xì)胞移植后死亡的主要原因。中性粒細(xì)胞(PMN)是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分,它通過吞噬等方式來抵御和消滅入侵的病原微生物,與機(jī)體的非特異性抗感染過程有關(guān),該類細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬殺菌功能,其作用過程歷經(jīng)趨化運(yùn)動(dòng),識(shí)別并結(jié)合吞噬物質(zhì),進(jìn)而攝入胞內(nèi),最終殺傷并降解病原體。煙曲霉的代謝產(chǎn)物(Af D)可通過抑制免疫反應(yīng)或破壞局部組織從而導(dǎo)致人及動(dòng)物的侵襲性曲霉病。而對(duì)于免疫功能正常的人來說,吞噬的煙曲霉菌易被PMN細(xì)胞殺滅并清除。但關(guān)于造血干細(xì)胞移植后患者中性粒細(xì)胞的功能、對(duì)曲霉菌的吞噬作用改變及機(jī)制尚未完全清楚。因此本論文以健康人和造血干細(xì)胞移植患者(4-6周)外周血PMN細(xì)胞為研究對(duì)象,在體外培養(yǎng)條件下給予煙曲霉孢子及其代謝產(chǎn)物在刺激后,分別應(yīng)用光鏡、電鏡技術(shù)觀察中性粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞體積大小、呼吸爆發(fā)產(chǎn)生超氧離子(O2-)水平、中性粒細(xì)胞表面CD64表達(dá)水平及其吞噬率和吞噬指數(shù)的改變,探討造血干細(xì)胞移植患者PMN對(duì)煙曲霉和其代謝產(chǎn)物混合作用的反應(yīng)性,初步探討造血干細(xì)胞移植患者易患煙曲霉病的可能機(jī)制。首先利用新方法分離和純化外周血健康人和造血干細(xì)胞移植患者的PMN,經(jīng)姬姆薩染液染色后確認(rèn)可制得純度95%的PMN細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)排斥法測(cè)PMN細(xì)胞活性98%。光鏡下我們發(fā)現(xiàn)健康人的PMN細(xì)胞核呈桿狀或2~5分葉狀,葉與葉間有細(xì)絲相連,造血干細(xì)胞移植患者中性粒細(xì)胞胞漿核增大,中幼至分葉核嗜酸性粒細(xì)胞部分明顯增大;通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)健康人PMN細(xì)胞體積大小基本相同,造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞體積大小有差異,其細(xì)胞平均體積比健康人大,這與流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)PMN細(xì)胞體積大小結(jié)果相符。上述結(jié)果說明造血干細(xì)胞移植患者血液中的PMN多以不成熟的幼稚狀態(tài)存在。接下來將煙曲霉孢子及代謝產(chǎn)物與分離所得的高純度中PMN細(xì)胞共同孵育2小時(shí),然后利用PAS(Periodic Acid-Schiff)染色、電鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)觀察中性粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化與吞噬功能的關(guān)系。加入孢子混合液(煙曲霉孢子+Af D)刺激PMN2小時(shí)后透射電鏡下我們發(fā)現(xiàn)健康人PMN細(xì)胞對(duì)煙曲霉孢子的吞噬率和吞噬指數(shù)在Af D存在與不存在的情況下無明顯改變,但造血干細(xì)胞移植患者PMN同時(shí)粘附和吞噬孢子數(shù)比健康人少,線粒體腫脹明顯,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,并可見部分胞質(zhì)內(nèi)局灶性壞死;更為顯著的是PAS染色后也發(fā)現(xiàn)Af D可以顯著抑制造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞對(duì)煙曲霉孢子的吞噬率和吞噬指數(shù);通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN細(xì)胞內(nèi)含有CFSE標(biāo)記的煙曲霉孢子的數(shù)量進(jìn)一步證實(shí)了Af D抑制HSCT患者PMN細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子能力的影響。為了進(jìn)一步探索影響造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞吞噬功能改變的可能機(jī)制,我們通過運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PMN細(xì)胞活性氧分析呼吸爆發(fā)產(chǎn)生O2-水平;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面CD64表達(dá)水平分析中性粒細(xì)胞抗感染能力。流式檢測(cè)結(jié)果顯示造血干細(xì)胞移植患者PMN經(jīng)孢子混合液(煙曲霉孢子+Af D)刺激后PMN呼吸爆發(fā)產(chǎn)生O2-水平明顯低于健康人群,而且Af D對(duì)造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞O2-產(chǎn)生的抑制作用顯著高于健康人PMN。我們推測(cè)Af D的細(xì)胞毒素所致的O2-產(chǎn)生水平的下降可能與造血干細(xì)胞移植患者PMN抗煙曲霉菌的能力降低密切相關(guān)。造血干細(xì)胞移植患者PMN表面CD64表達(dá)在煙曲霉孢子+Af D刺激前后期表達(dá)無明顯變化,但造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞CD64本底表達(dá)水平顯著低于健康人PMN細(xì)胞,這可能與HSCT中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)水平降低有關(guān)。通過以上實(shí)驗(yàn)研究,我們推測(cè)造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞對(duì)易感煙曲霉菌與其吞噬功能的降低及其PMN細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生低水平O2-和其本身CD64呈低水平表達(dá)密切相關(guān);Af D顯著抑制造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞的吞噬功能、活性氧產(chǎn)生;且進(jìn)一步證明了健康人和造血干細(xì)胞移植患者的中性粒細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的變化和其功能變化的相關(guān)性,但關(guān)于Af D對(duì)造血干細(xì)胞移植患者PMN細(xì)胞吞噬功能影響的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R457.7
【目錄】：

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