發(fā)布時(shí)間：2018-01-11 01:13

  本文關(guān)鍵詞：不同方法純化顆粒脂肪的效果評(píng)價(jià)及其對(duì)移植后轉(zhuǎn)歸的影響　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：自體脂肪移植術(shù)(autologus fat transplantation,AFT),又稱(chēng)自體脂肪注射,是利用自身脂肪組織作為填充材料修復(fù)皮下軟組織缺損一種手段。與人造材料和異種材料相比,自體脂肪獲取便捷,價(jià)格低廉且具有更好生物相容性,在整形美容外科中的應(yīng)用非常廣泛。臨床工作中,移植后脂肪的存活情況是醫(yī)患雙方最為關(guān)注的問(wèn)題,而抽吸后脂肪的純化處理與脂肪組織的存活情況直接相關(guān)。目的對(duì)棉墊吸附(AWG,Absorptionwithgauze)法、離心分離(CEN,Centrifugation)法以及靜置沉淀(DEC,Decantation)法純化處理脂肪的效果進(jìn)行評(píng)價(jià),并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)移植物轉(zhuǎn)歸進(jìn)行比較分析,以初步探索其影響移植物存留和轉(zhuǎn)歸的具體機(jī)制。方法將人腹部來(lái)源的抽吸顆粒脂肪分別經(jīng)棉墊吸附法、離心分離法、靜止沉淀法進(jìn)行純化處理。在體外實(shí)驗(yàn)中,將純化后脂肪經(jīng)高速離心處理,使得液體成分、油脂、脂肪組織分離,測(cè)量各自體積以評(píng)價(jià)不同方法的純化效力。通過(guò)組織學(xué)檢測(cè)和代謝功能檢測(cè)對(duì)不同方法純化后脂肪組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性進(jìn)行比較;經(jīng)膠原酶消化獲得脂肪組織中的血管周?chē)�基質(zhì)成分(Stromal Vascular Fraction,SVFs),利用流式細(xì)胞分析儀對(duì)中的細(xì)胞成分進(jìn)行分析;將SVFs細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至第三代,獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs,)利用 CCK8(Cell Counting Kit-8)試劑繪制細(xì)胞增殖曲線,并對(duì)其細(xì)胞周期和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)成脂、成骨、成軟骨分化對(duì)其分化活性進(jìn)行比較;使用免疫缺陷小鼠構(gòu)建顆粒脂肪移植的動(dòng)物模型,于注射后3天,6天,9天,12天,3周,6周,9周,12周取出移植后脂肪。通過(guò)稱(chēng)取移植物重量、測(cè)量體積對(duì)不同方法純化后脂肪組織的存留情況進(jìn)行比較;組織學(xué)用脂周蛋白染色標(biāo)記活性良好的脂肪細(xì)胞,比較不同方法純化后脂肪在體內(nèi)的存活情況。利用液相芯片、Western blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR,從血管再生、炎性物質(zhì)表達(dá)、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)與膠原重構(gòu)等幾個(gè)方面觀察脂肪移植物的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸,進(jìn)而探索不同的顆粒脂肪純化方法對(duì)脂肪移植物存留的影響。結(jié)果不同方法純化后脂肪中含水量由高到低依次為:靜止沉淀組、離心分離組、棉墊吸附組;與之相反,脂肪組織的含量由高到低依次為:棉墊吸附組、靜置沉淀組、離心分離組;而離心組純化脂肪高速離心后,分離出的油脂高于靜止組和棉墊組。不同方法純化后脂肪組織在結(jié)構(gòu)完整性、葡萄糖代謝能力等方面均無(wú)顯著差異。不同方法純化后脂肪組織中SVFs及ADSCs的含量由高到低依次為:棉墊組、離心組、靜止組。而紅細(xì)胞的含量由高到低依次為:靜止組、離心組、棉墊組。三種純化方法對(duì)ADSCs的增殖活性、細(xì)胞周期和凋亡情況的影響基本一致。三種方法對(duì)ADSCs分化活性的影響無(wú)明顯差異。移植后脂肪體積隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但隨著時(shí)間延長(zhǎng)下降幅度逐漸減小。在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn),移植物體積比較:棉墊組離心組靜止組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn),移植物重量比較:棉墊組離心組靜止組。且下降幅度大于體積。組織學(xué)檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn),脂肪移植后脂肪組織的轉(zhuǎn)歸趨勢(shì)為:脂肪細(xì)胞退變(去分化和崩解壞死)并伴隨炎性物質(zhì)表達(dá)增加→形成囊腔結(jié)構(gòu)→膠原沉積→血運(yùn)重建→脂肪再生的基本趨勢(shì)。離心分離法純化后脂肪組織中在脂肪細(xì)胞退變過(guò)程中,更多發(fā)生脂肪細(xì)胞的崩解壞死,少見(jiàn)去分化的脂肪細(xì)胞。利用蛋白液相芯片技術(shù)對(duì)移植后早期脂肪組織中細(xì)胞的早期凋亡情況進(jìn)行檢測(cè),對(duì)于移植物中多種炎性因子的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn),多數(shù)炎性因子呈現(xiàn)低表達(dá),IL-6,IL-1,GM-CSF,IFN-g在脂肪移植后早期顯著增高后回落;IL-10、IL-12、IL13在脂肪組織中表達(dá)量極低,其表達(dá)不受是否植入體內(nèi)和時(shí)間變化的影響。IL-2、IL-4、IL-5、IFN-G、TNF-α雖然在組織中有一定表達(dá),但并未受到不同干預(yù)因素和移植處理的影響。離心分離組移植后早期炎性物質(zhì)IL-6,IL-1表達(dá)更高,與靜置沉淀法和棉墊吸附法純化后脂肪組織間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1.抽吸后脂肪組織的濃縮純化效果與移植后脂肪的組織存留量直接相關(guān):純化濃縮效果越好,移植后脂肪組織的存留率越高。三種純化方法相比較,棉墊吸附法純化效果最好,離心分離法次之,靜置沉淀法濃縮純化效率最低。2.離心分離法(1200g離心力,3min)在純化過(guò)程中對(duì)脂肪細(xì)胞造成了臨界的機(jī)械損傷,在體外的功能檢測(cè)中不易發(fā)現(xiàn),但在移植后的失養(yǎng)環(huán)境中,脂肪細(xì)胞出現(xiàn)更多的崩解壞死。3.在免疫缺陷裸小鼠構(gòu)建的脂肪移植模型中,脂肪組織的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸可以劃分為三個(gè)階段(1)快速損耗與炎癥啟動(dòng)期(D1-D7)—移植物中液體成分的快速吸收,移植物存留量減少,同時(shí)炎性物質(zhì)表達(dá)逐漸增加;(2)脂肪退變與血運(yùn)重建期(W1-W3)—脂肪細(xì)胞發(fā)生崩解壞死和去分化,炎性物質(zhì)迅速到達(dá)峰值后回落,新生血管逐漸形成(3)基質(zhì)重構(gòu)與脂肪再生期(W3-)---前期大量膠原沉積,后期逐漸降解,新生脂肪細(xì)胞出現(xiàn)并逐漸增多。4.良好的濃縮效果,使得棉墊吸附組和離心分離組移植物中的ASCs富集,移植后脂肪中VEGFR表達(dá)高,膠原重構(gòu)發(fā)生早,有益于脂肪細(xì)胞的再生。5.由于脂肪細(xì)胞活性受損,離心分離法純化后脂肪組織移植后IL-1,IL-6等炎性物質(zhì)表達(dá)增高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R622.9

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