發(fā)布時(shí)間：2021-07-30 16:24

  研究背景及意義乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生癌變的惡性腫瘤,在世界上嚴(yán)重威脅人類健康。在發(fā)達(dá)國(guó)家及地區(qū),患乳腺癌的概率及其死亡率均居女性惡性腫瘤之首。近年來(lái)乳腺癌治療方式不斷進(jìn)展,由手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、分子生物靶向治療和中醫(yī)藥治療結(jié)合的綜合治療已成為當(dāng)前治療乳腺癌的主流模式,乳腺癌的治療療效不斷提高,已成為預(yù)后較好的實(shí)體腫瘤之一。但是,目前全球乳腺癌的發(fā)病率每年都在增加,在中國(guó),乳腺癌的發(fā)病率在女性疾病中占據(jù)第一位,并且有年輕化的趨勢(shì),成為危害女性身心健康的頭號(hào)殺手。因此防治乳腺癌具有重要的意義。近年來(lái),在乳腺癌分子代謝重編方面的研究有了一些進(jìn)展。例如,在乳腺癌中,丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)能通過(guò)調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子1 α來(lái)調(diào)節(jié)乳腺癌的增殖。支鏈氨基酸(BCAAs),主要有亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸,是重要的營(yíng)養(yǎng)信號(hào),對(duì)機(jī)體活動(dòng)有直直接和間接的影響。血漿中BCAAs水平和心血管疾病的發(fā)生有關(guān),并且血清中高水平BCAAs和人類未來(lái)糖尿病有極大的聯(lián)系,這可能是因?yàn)锽CAAs能影響胰島素耐受性。BCAAs分解代謝缺陷也會(huì)引起疾病。例如,在血腦屏障期受損的氨基酸運(yùn)輸能降低腦鏈氨基酸的正常水平,并且誘導(dǎo)支鏈氨基酸的代謝缺陷。另外,支鏈氨基酸分解代謝缺陷是心力衰竭的代謝標(biāo)志,能夠促進(jìn)心力衰竭。支鏈氨基酸還參與癌癥的發(fā)生及發(fā)展。血漿中,支鏈氨基酸的高水平增加胰腺癌發(fā)生的兩倍風(fēng)險(xiǎn)。支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1(BCAT1)能夠激發(fā)支鏈氨基酸的分解代謝,在攜帶異檸檬酸脫氫酶1的人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中,BCAT1能夠通過(guò)氨基酸代謝促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。在非小細(xì)胞肺癌中,BCAT1和BCAT2的損失能夠破壞非小細(xì)胞肺癌的形成。BCAT1可能通過(guò)調(diào)控線粒體的合成及功能影響乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展,線粒體的生物合成和功能與許多因子有關(guān),如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1 α)、呼吸因子(NRF-1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶以及活性氧(ROS)。然而,支鏈氨基酸分解代謝在乳腺癌血液及組織中的作用仍未知。本次研究支鏈氨基酸代謝在人類乳腺癌中的潛在作用。本研究共分為四個(gè)部分,第一部分,收集山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院2010到2015年共計(jì)200例乳腺癌患者及100例正常人。應(yīng)用LC-MS、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)支鏈氨基酸及核心酶在腫瘤患者血漿及腫瘤組織中的表達(dá)。第二部分,采用shRNA和siRNA技術(shù)干擾人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/T47D中BCAT1的表達(dá),觀察干擾BCAT1對(duì)MCF-7/T47D細(xì)胞增殖、克隆形成的影響。第三部分,采用實(shí)時(shí)定量PCR、分光光度法、mitoSOX染色法等檢測(cè)線粒體生物合成的調(diào)節(jié)因子表達(dá)、檸檬酸合酶活性、細(xì)胞ATP水平、線粒體ROS及抗氧化劑表達(dá),來(lái)探究BCAT1對(duì)線粒體生物合成及功能的影響。第四部分,通過(guò)檢測(cè)mTOR的蛋白表達(dá)、線粒體DNA含量、線粒體ROS,探究BCAT1影響乳腺癌細(xì)胞增殖速度及克隆能力的分子機(jī)制。第一部分支鏈氨基酸及核心酶在乳腺癌中的表達(dá)研究目的:1、探究支鏈氨基酸在乳腺癌病人血液及癌組織中的水平。2、探究影響支鏈氨基酸代謝的核心酶表達(dá)。研究方法:1.選取在2010到2015年于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的200例乳腺癌病人以及100例健康志愿者。收集其血漿、腫瘤組織和癌旁無(wú)腫瘤組織,-80℃保存組織標(biāo)本以備檢測(cè);2.采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測(cè)定支鏈氨基酸在乳腺癌患者及健康志愿者中的血漿水平圖:3.檢測(cè)乳腺癌患者和正常人的血漿中、乳腺癌患者腫瘤組織和癌旁無(wú)腫瘤組織標(biāo)本中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的表達(dá);4.采用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1在乳腺癌患者及健康志愿者中的表達(dá);研究結(jié)果:1.與正常捐贈(zèng)者相比,亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);2.乳腺癌患者腫瘤組織中的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸水平顯著高于癌旁非腫瘤組織(p0.05);3.乳腺癌患者腫瘤組織中的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織(p0.05);結(jié)論:總的來(lái)說(shuō),支鏈氨基酸水平及支鏈氨基酸降解酶在乳腺癌患者中的表達(dá)水平顯著升高(p0.05),這表明在乳腺癌組織中,支鏈氨基酸代謝被激活,從而有助于制定乳腺癌的治療方案及預(yù)后。第二部分干擾BCAT1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及克隆能力的影響研究目的:1.探究BCAT1過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及克隆形成的影響;2.探究干擾BCAT1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及克隆形成的影響;研究方法:1.將購(gòu)買好的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中,空白表達(dá)的質(zhì)粒作為對(duì)照組,構(gòu)建BCAT1沉默組(shBCAT1組)、對(duì)照組(shCtrl組)、BCAT1過(guò)表達(dá)組及對(duì)照組(Ctrl組),采用蛋白印記驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功;2.采用CCK-8比色法探究BCAT1過(guò)表達(dá)和沉默對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D細(xì)胞增殖能力的影響。3.采用平板克降形成實(shí)驗(yàn)探索BCAT1過(guò)農(nóng)達(dá)和沉默對(duì)MCF-7和T47D細(xì)胞系的細(xì)胞克降形成能力的影響;研究結(jié)果:1.蛋白印跡顯示,轉(zhuǎn)染72小時(shí)后,與對(duì)照組相比,shBCAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中BCAT1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05),而B(niǎo)CAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中BCAT1的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。2.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示,與shCtrl組相比,從24h開(kāi)始,shBCAT1組增殖活性開(kāi)始明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,與shCtrl組相比,sh BCAT1組的克隆細(xì)胞數(shù)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示,與Ctrl組相比,從24h開(kāi)始,BCAT1組增殖活性開(kāi)始明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)顯示,與Ctrl組相比,BCAT1組的克隆細(xì)胞數(shù)顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.病毒及質(zhì)粒感染能夠有效上調(diào)和下調(diào)BCAT1的表達(dá);2.BCAT1過(guò)表達(dá)能夠提高乳腺癌細(xì)胞的增殖及克隆形成,BCAT1沉默能夠降低乳腺癌細(xì)胞的增殖及克隆形成;第三部分BCAT1調(diào)節(jié)線粒體的生物合成及功能研究目的:1.探究BCAT1在調(diào)節(jié)線粒體生物合成中的作用2.探究BCAT1對(duì)線粒體生物功能的影響研究方法:1.通過(guò)測(cè)定人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中線粒體DNA含量,探究BCAT1能否調(diào)節(jié)線粒體生物合成及功能;2.采用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)Ctrl組、BCAT1組、shCtrl組、shBCAT1組中線粒體生物合成關(guān)鍵基因-過(guò)氧化酶體增生物激活受體、核呼吸因子1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A、β3-F1型ATP合成酶-的mRNA表達(dá);3.采用分光光度法檢測(cè)shCtrl組、shBCAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中的檸檬酸合酶活性;4.采用mitoSOX染色檢測(cè)shCtrl組、shBCAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中線粒體ROS;5.采用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)shCtrl組、shBCAT1組中超氧化物歧化酶1.超氧化物歧化酶2.過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶抗的mRNA表達(dá);研究結(jié)果:1.BCAT1沉默降低MCF-7/T47D細(xì)胞系中的線粒體DNA含量,而B(niǎo)CAT1過(guò)表達(dá)增加了MCF-7/T47D細(xì)胞系中的線粒體DNA含量(p0.05);2.BCAT1沉默降低過(guò)氧化酶體增生物激活受體、核呼吸因子1、線粒體轉(zhuǎn)錄因了A、β-F1型ATP合成酶的mRNA水平,BCAT1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致相反的結(jié)果;3.BCAT1沉默降低檸檬酸合酶活性水平,抑制超氧化物歧化酶1,超氧化物歧化酶2.過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶mRNA水平,并且誘導(dǎo)線粒體ROS的增加;結(jié)論:1.BCAT1能夠通過(guò)增加線粒體數(shù)目、提高影響線粒體生物合成的調(diào)節(jié)因子來(lái)影響線粒體的生物合成;2.BCAT1能通過(guò)提高檸檬酸合酶活性、抗氧化劑-超氧化物歧化酶1,超氧化物歧化酶2,過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-的mRNA水平以及抑制線粒體ROS來(lái)影響線粒體功能;第四部分BCAT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞系mTOR的影響研究目的:1.探究BCAT1對(duì)乳腺癌組織中關(guān)鍵蛋白AMPK和mTOR磷酸化水平的影響。2.探究受BCAT1影響的mTOR對(duì)線粒體功能及乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。研究方法:1.采用蛋白印跡法檢測(cè)shCtrl組、shBCAT1組p-AMPK、AMPK、SIRT1的蛋白表達(dá),并使用蛋白印跡法測(cè)定shCtrl組、shBCAT1組及Ctr1組、BCAT1組 p-mTOR、mTOR、p-S6K1 和 S6K1 的蛋白表達(dá);2.使用雷帕霉素抑制乳腺癌細(xì)胞系中的mTOR,并采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BCAT1過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系中 PGC1α、NRF-1、Tfam、β-F1-ATPase、SOD1、SOD2、過(guò)氧化氫酶和Gpx1的mRNA水平;3.測(cè)定 Ctrl+Vechicle 組、BCAT1+Vechicle 組、Ctrl+Rapamycin 組、BCAT1+Rapamycin組乳腺癌細(xì)胞系中的線粒體DNA含量、線粒體ROS、細(xì)胞克隆數(shù)和細(xì)胞增殖情清況。研究結(jié)果:1.BCAT1沉默不會(huì)影響AMPK和SIRT1的蛋白表達(dá)、mTOR信號(hào),BCAT1過(guò)表達(dá)激活mTOR信號(hào);2.雷帕霉素能抑制mTOR信號(hào),而mTOR通路被抑制的人乳腺癌細(xì)胞中,BCAT1過(guò)表達(dá)不會(huì)影響PGC1α、NRF-1、Tfam、β-F1-ATP酶、SOD1、SOD2、過(guò)氧化氧酶和Gpx1的mRMA水平;3.mTOR通路被抑制能夠阻止BCAT1對(duì)線粒體生物合成及線粒體ROS的影響;4.mTOR通路被抑制能夠減弱BCAT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖速度及克隆形成能力的促進(jìn)作用。結(jié)論:1.BCAT 1通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)影響線粒體功能;2.mTOR有助于BCAT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1407795