發(fā)布時(shí)間：2018-01-10 11:29

  本文關(guān)鍵詞：調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的長(zhǎng)鏈非編碼RNA發(fā)現(xiàn)及小分子化合物的干預(yù)研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：巨噬細(xì)胞是造血系統(tǒng)中可塑性最強(qiáng)的免疫細(xì)胞,研究表明,巨噬細(xì)胞根據(jù)所處微環(huán)境刺激信號(hào)的不同,可極化為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞),在正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和對(duì)病原體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。作為腫瘤微環(huán)境中最為常見的免疫細(xì)胞,存在于腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,越來(lái)越多的研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞具有M2樣的表型,并且在腫瘤的發(fā)生和惡性演進(jìn)中發(fā)揮著極重要的作用,被認(rèn)為是可用于腫瘤治療的藥物作用靶細(xì)胞,但是調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型極化的具體分子機(jī)制一直是該領(lǐng)域的研究難點(diǎn),尚無(wú)突破性進(jìn)展。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)堿基的RNA分子,它們并不編碼完整的蛋白,而是以RNA的形式在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控基因的表達(dá)水平從而影響生命活動(dòng),被認(rèn)為是一個(gè)調(diào)控生命的全新"維度"。近年來(lái)已有文獻(xiàn)表明lncRNA在調(diào)控細(xì)胞分化中起著重要的作用,但對(duì)于其與巨噬細(xì)胞M2型極化的調(diào)控卻鮮見報(bào)道。本文將利用經(jīng)典的M2型巨噬細(xì)胞極化因子,構(gòu)建穩(wěn)定的體外M2型極化模型,應(yīng)用lncRNA基因芯片技術(shù),鑒定在M2型極化過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵lncRNA,并在此基礎(chǔ)上深入研究其調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的分子機(jī)制;在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)對(duì)關(guān)鍵lncRNA及巨噬細(xì)胞M2型極化具有干預(yù)作用的小分子化合物,研究其干預(yù)作用的分子機(jī)制,探討小分子化合物對(duì)于腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響,以期從巨噬細(xì)胞M2型極化出發(fā)為干預(yù)腫瘤的發(fā)生帶來(lái)新的思路。第一部分 調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的lncRNA發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制研究研究目的:本部分旨在發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞M2型極化過(guò)程中起調(diào)控作用的lncRNA,研究其介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化的分子機(jī)制以及對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,為干預(yù)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型極化提供潛在的靶點(diǎn)。研究方法:本部分研究采用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7和小鼠原代巨噬細(xì)胞BMDM作為研究對(duì)象。(1)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)典刺激因子IL4和IL13對(duì)巨噬細(xì)胞M2型極化的表面標(biāo)記物CD206和CD209的表達(dá)影響,以考察巨噬細(xì)胞M2型極化情況;(2)在構(gòu)建穩(wěn)定模型的基礎(chǔ)上,收集不同來(lái)源巨噬細(xì)胞,不同刺激時(shí)間的樣本進(jìn)行基因芯片技術(shù)分析相關(guān)差異lncRNA的表達(dá);(3)通過(guò)siRNA技術(shù)干擾目標(biāo)lncRNA的表達(dá),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M2型極化的相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)情況;(4)Transwell小室法檢測(cè)siRNA技術(shù)干擾目標(biāo)lncRNA的表達(dá)后,對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響;(5)通過(guò)管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA技術(shù)干擾目標(biāo)lncRNA的表達(dá)后,對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的影響;(6)Western blot法檢測(cè)siRNA技術(shù)干擾目標(biāo)lncRNA的表達(dá)后,巨噬細(xì)胞M2型極化相關(guān)信號(hào)通路的變化情況。研究結(jié)果:(1)應(yīng)用M2型極化誘導(dǎo)因子IL4或IL13誘導(dǎo)發(fā)生M2型極化,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206和CD209,發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細(xì)胞和BMDM細(xì)胞中,IL4或IL13均能誘導(dǎo)M2型表面標(biāo)記物CD206和CD209表達(dá)增加。(2)應(yīng)用IL13作用于RAW264.7細(xì)胞和BMDM細(xì)胞,通過(guò)lncRNA基因芯片技術(shù)測(cè)序發(fā)現(xiàn):RAW264.7細(xì)胞中,共有55個(gè)lncRNA在不同時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生5倍以上增加,BMDM細(xì)胞中共有104個(gè)lncRNA發(fā)生5倍以上增加;其中發(fā)生增加的lncRNA共有9個(gè),數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)lncRNA-RIK可能具有調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的作用。(3)應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)LPS、IL4和IL13不同因子刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型和M2型極化之后lncRNA-RIK表達(dá)水平變化,發(fā)現(xiàn)lncRNA-RIK特異性地在M2型極化過(guò)程中發(fā)生增加(在RAW264.7細(xì)胞中,IL4或IL13刺激后lncRNA-RIK表達(dá)水平分別增加8.39 ± 2.94倍和8.17 ± 3.77倍,p值分別為0.0486和0.0301;在BMDM細(xì)胞中,IL4或IL13刺激后lncRNA-RIK表達(dá)水平分別增加2.02 ± 0.31倍和3.78 ± 0.36倍,p值分別為0.0049和0.0002)。(4)通過(guò)siRNA技術(shù)干擾巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-RIK的表達(dá)后,巨噬細(xì)胞在IL4或IL13刺激下的M2型極化受到顯著抑制(各組別p值均小于0.05);(5)通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力,但是沉默lncRNA-RIK的表達(dá)后不能逆轉(zhuǎn)此作用。(6)采用管腔形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)HUVEC細(xì)胞管腔形成能力,但是沉默lncRNA-RIK的表達(dá)后不能逆轉(zhuǎn)此作用。(7)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL4或IL13作用巨噬細(xì)胞后,M2型極化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT6原型蛋白未發(fā)生改變,磷酸化化水平增加,沉默lncRNA-RIK的表達(dá)后,STAT6的磷酸化水平下降。研究結(jié)論:lncRNA-RIK通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT6的磷酸化水平調(diào)控巨噬細(xì)胞的M2型極化,干擾lncRNA-RIK的表達(dá)可影響M2型巨噬細(xì)胞的促進(jìn)血管生成能力,提示lncRNA-RIK可能是調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化的關(guān)鍵因子。第二部分 干預(yù)巨噬細(xì)胞M2型極化相關(guān)IncRNA的小分子化合物Fenretinide的發(fā)現(xiàn)及其機(jī)制研究研究目的:基于所發(fā)現(xiàn)的調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的lncRNA-RIK,我們篩選發(fā)現(xiàn)抗腫瘤候選化合物Fenretinide(4-HPR)對(duì)lncRNA-RIK的表達(dá)具有抑制作用。因此,本部分將進(jìn)一步評(píng)價(jià)4-HPR對(duì)lncRNA-RIK及巨噬細(xì)胞M2型極化的調(diào)控作用,在此基礎(chǔ)上探討4-HPR抑制巨噬細(xì)胞M2型極化的分子機(jī)制,研究巨噬細(xì)胞M2型極化在4-HPR介導(dǎo)腫瘤預(yù)防中的作用地位,為4-HPR的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。研究方法:本研究采用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7、原代巨噬細(xì)胞BMDM和結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT116,SW620和SW480)作為研究對(duì)象。(1)應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)4-HPR作用巨噬細(xì)胞后,考察lncRNA-RIK表達(dá)水平變化;(2)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M2型極化的表面標(biāo)記物CD206的表達(dá)來(lái)考察4-HPR對(duì)于巨噬細(xì)胞M2型極化的影響,通過(guò)Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)4-HPR對(duì)于巨噬細(xì)胞M2型極化標(biāo)記物mRNA水平的影響;(3)采用管腔形成實(shí)驗(yàn),考察給予4-HPR作用后,M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC管腔形成的能力的影響;(4)Western blot檢測(cè)給予4-HPR作用后,巨噬細(xì)胞M2型極化相關(guān)信號(hào)通路STAT6的激活情況;(5)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠APCmin/+自發(fā)結(jié)腸癌的動(dòng)物模型,考察4-HPR對(duì)于腸道腫瘤發(fā)生的影響;(6)通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)4-HPR處理小鼠的腸道組織中的M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;(7)通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)4-HPR處理小鼠的腸道組織中的血管生成情況。研究結(jié)果:(1)應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),刺激因子IL4和IL13可誘導(dǎo)lncRNA-RIK表達(dá)增加,但是4-HPR作用后lncRNA-RIK表達(dá)水平降低(IL4單用組較與4-HPR聯(lián)合應(yīng)用組相比,由6.09 ± 1.83倍下降至0.12 ± 0.03倍,p=0.0051;IL13單用組較與4-HPR聯(lián)合應(yīng)用組相比,由8.18 ±3.08倍下降至0.18 ±0.09倍,p=0.0020)。(2)采取兩個(gè)體外模型評(píng)價(jià)4-HPR對(duì)巨噬細(xì)胞M2型極化的抑制作用,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206,結(jié)果顯示4-HPR可明顯抑制IL4或IL13誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞M2型極化標(biāo)記物的表達(dá)。(3)應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)4-HPR可抑制巨噬細(xì)胞M2型極化的特異性基因Fizz-1和PPAR-γ的mRNA水平。(4)為了探討4-HPR抑制巨噬細(xì)胞M2型極化的機(jī)制,首先考察活性氧簇在巨噬細(xì)胞M2型極化過(guò)程中發(fā)揮的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)還原性物質(zhì)NAC和GSH,均不能逆轉(zhuǎn)4-HPR對(duì)巨噬細(xì)胞M2型極化的抑制作用,提示4-HPR調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化與經(jīng)典的氧化應(yīng)激途徑無(wú)關(guān)。(5)Western Blot進(jìn)一步考察調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的經(jīng)典信號(hào)通路JAK2-STAT6信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)4-HPR作用巨噬細(xì)胞后,可抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT6的磷酸化水平,從而影響巨噬細(xì)胞的M2型極化。(6)采用管腔形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)HUVEC細(xì)胞管腔形成能力,給予4-HPR作用的M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基可抑制HUVEC管腔形成能力。(7)采用APCmin/+轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)腸道腫瘤的動(dòng)物模型,檢測(cè)4-HPR的腫瘤預(yù)防作用,結(jié)果顯示20mg/kg的4-HPR可以顯著減少腸道腫瘤的數(shù)目(對(duì)照組平均腫瘤發(fā)生數(shù)目為14±8個(gè),4-HPR給藥組為6±7個(gè),p=0.0088)。(8)免疫組化方法檢測(cè)小鼠的腸道組織中的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206的表達(dá),發(fā)現(xiàn)4-HPR處理小鼠的腸道組織中CD206的表達(dá)減少。(9)免疫組化方法檢測(cè)小鼠的腸道組織中的血管標(biāo)記物CD31的表達(dá),發(fā)現(xiàn)4-HPR處理小鼠腸道腫瘤部位的CD31表達(dá)減少。(10)免疫組化檢測(cè)Ki67的表達(dá),發(fā)現(xiàn)4-HPR并不影響小鼠腸道腫瘤細(xì)胞的增殖;TUNEL染色檢測(cè)小鼠腸道腫瘤細(xì)胞的凋亡情況,發(fā)現(xiàn)4-HPR不引起腫瘤細(xì)胞凋亡。研究結(jié)論:篩選得到調(diào)控lncRNA-RIK表達(dá)的小分子化合物4-HPR,可抑制巨噬細(xì)胞的M2型極化,并且可以抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT6的磷酸化水平。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4-HPR可通過(guò)干預(yù)巨噬細(xì)胞M2型極化發(fā)揮預(yù)防腸道腫瘤的作用,提示4-HPR是一個(gè)有效抑制巨噬細(xì)胞M2型極化的小分子化合物,具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 Wenwen Jia;Wen Chen;Jiuhong Kang;;The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

2 Christoph Roderburg;Jhenee Bubenzer;Michael Spannbauer;Nicole do O;Andreas Mahnken;Tom Luedde;Christian Trautwein;Jens JW Tischendorf;;Long-term survival of a HCC-patient with severe liver dysfunction treated with sorafenib[J];World Journal of Hepatology;2010年06期

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本文編號(hào)：1405125