發(fā)布時間：2020-10-27 05:34

　　 研究背景 石棉是自然界存在的纖維狀物質,具有保溫、隔熱、絕緣和隔音等性能。石棉作為工業(yè)原料和材料己有數千年的歷史,目前石棉相關制品有3000多種,主要應用于汽車、化工和電器設備等工業(yè)部門。盡管石棉在工業(yè)發(fā)展中有重要作用,但是長期接觸石棉可引起肺部組織纖維化,甚至誘發(fā)支氣管肺癌和間皮瘤。石棉共分兩大類：溫石棉(Chrysotile Fibers, CF)和角閃石類石棉,在所有的石棉中,致病能力最強的是角閃石棉中的青石棉[21,但對于溫石棉是否具有致癌、致纖維化的能力,還有爭議。我國的政策是禁止使用角閃石石棉,安全使用溫石棉。由于石棉具有致癌性,出現了人工合成的石棉替代品,稱人造礦物纖維(Man-Made Mineral Fibers, MMMF),也稱人造玻璃纖維(Man-Made Vitreous Fibers, MMVF),常用的品種有：玻璃棉(Glass Wool, GW)、巖棉(Rock Wool, RW)和渣棉(Slag Wool),耐火陶瓷纖維(Refractory Ceramic Fiber, RCF)等。然而有研究表明,石棉替代品同樣具有生物活性和致病的可能性,其致病機理和分子機制目前尚在研究之中。 溫石棉及替代品的體外實驗可以提供對人體的生物危害及其分子機制等信息。無嘌呤/無嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactor-1, APE/Ref-1)是一種具有DNA修復、氧化還原以及調節(jié)轉錄因子活性的多功能蛋白；多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1)是DNA損傷感應及監(jiān)測分子,其參與許多重要的生命活動如凋亡、轉錄、DNA修復、細胞死亡等。 本項研究通過細胞毒性試驗、形態(tài)學觀察和分子生物學等實驗方法,研究RCF1、 GW1、RW1和CF致人支氣管上皮細胞(Human Bronchial Epithelial Cells, BEAS-2B)和人胸膜間皮細胞(Human Pleural Mesothelial Cells, Met-5A)損傷的作用,為探尋纖維誘發(fā)細胞病變的機理提供依據。本課題應用RNA干擾技術建立PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷細胞株,為闡明RCF1、GW1、RW1和CF引起細胞毒性的分子機理提供細胞工具。 研究目的 評估RCF1、GW1、RW1和CF對BEAS-2B和Met-5A細胞的細胞毒作用。評估APE/Ref-1的PARP-1在受試纖維刺激BEAS-2B和Met-5A細胞中的作用。 研究方法 1.體外培養(yǎng)Met-5A和BEAS-2B細胞,用RCF1、GW1、RW1和CF刺激細胞不同時間后,采用MTT法測定細胞活力的大小,彗星試驗檢測細胞DNA損傷程度和DNA損傷修復能力,流式細胞儀測細胞的凋亡率,熒光探針DHR123和DCFH-DA測細胞內(Reactive Oxygen Species, ROS)水平,掃描電子顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學變化,用NAC預處理細胞2h再用受試纖維刺激細胞24h,觀察纖維對細胞DNA損傷、凋亡的影響。 2.20μg/cm2纖維刺激細胞后,用RT-PCR和Western Blot檢測caspase-3、caspase-9、 APE/Ref-1和PARP-1的mRNA及蛋白表達水平。 3.利用RNA干擾技術構建PARP-1缺陷和APE/Ref-1缺陷的Met-5A和BEAS-2B細胞系。 4.沉默APE/Ref-1和PARP-1后,觀察纖維對基因缺陷細胞的凋亡和DNA損傷的影響。 結果 1. BEAS-2B和Met-5A細胞分別暴露于濃度為5至200μg/cm2的RCF1、GW1、RW1和CF纖維24h、48h和72h后發(fā)現,在低劑量(5μg/cm2)時有刺激細胞增殖的現象,在高劑量(20、40、100和200μg/cm2)時,細胞活力下降有明顯的劑量和時間反應關系。 2.掃描電鏡觀察發(fā)現,暴露于20μg/cm2纖維的細胞出現微絨毛損失、吞噬等現象。 3.細胞暴露于0～20μg/cm2纖維4h、24h和48h后,DNA損傷表現為時間依賴性和劑量依賴性增加(P0.05)。去除纖維刺激3小時后,細胞的DNA損傷可修復。NAC對細胞DNA損傷有拮抗作用。 4.分別用RCF1、RW1、GW1和CF刺激細胞后,發(fā)現細胞凋亡率增高,而GW1刺激細胞凋亡率小于其它纖維。RCF1、GW1、RW1和CF刺激細胞產生ROS的熒強度明顯大于空白組。NAC對細胞凋亡和ROS產生有抑制作用。 5.分別用RCF1、GW1、RW1和CF刺激BEAS-2B和Met-5A細胞后,發(fā)現caspase-3和caspase-9的mRNA和蛋白水平隨著時間的增加而增加。APE/Ref-1和PARP-1的mRNA和蛋白水平隨著時間的增加先增高而后下降。 6.本研究利用RNAi技術分別構建了Met-5A和BEAS-2B細胞的PARP-1基因缺陷細胞株和APE/Ref-1基因缺陷細胞株,基因缺陷細胞株與正常細胞株相比,mRNA表達水平下降了70～80%,蛋白質表達水平下降了80%以上,沉默效果顯著且穩(wěn)定性好。 7.分別用受試纖維刺激基因缺陷細胞和正常細胞,基因缺陷細胞的DNA損傷和細胞凋亡蛋白表達高于正常細胞。 結論： 1. RCF1、GW1、RW1和CF可誘導BEAS-2B和Met-5A細胞DNA損傷和細胞凋亡,ROS在其中起至關重要作用。 2. Caspase-3和caspases-9參與RCF1、GW1、RW1和CF誘導BEAS-2B和Met-5A細胞的凋亡過程。 3. PARP-1和APE/Ref-1缺陷可加重RCF1、GW1、RW1和CF對Met-5A和BEAS-2B細胞的DNA損傷程度和細胞凋亡蛋白表達。PARP-1和APE/Ref-1在RCF1、GW1、RW1和CF引起的細胞損傷中有重要作用。 4.本研究用慢病毒介導的RNAi技術成功構建了PARP-1和APE/Ref-1基因缺陷細胞株,沉默效果顯著且穩(wěn)定性好,為后續(xù)基因功能研究提供了有效的工具細胞。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R131
【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
英文縮略語
目錄
第一部分 溫石棉及其替代品致Met-5A細胞和BEAS-2B細胞的毒性作用
    1.1 引言
    1.2. 材料與方法
        1.2.1 主要材料
        1.2.2 主要試劑
        1.2.3 溶液配制
        1.2.4 儀器設備
        1.2.5 實驗方法與內容
    1.3 結果
        1.3.1 RCF1、GW1、RW1和CF刺激后BEAS-2B和Met-5A細胞的活力
        1.3.2 RCF1、GW1、RW1和CF致BEAS-2B細胞和Met-5A細胞的形態(tài)學改變
        1.3.3 RCF1、GW1、RW1和CF致BEAS-2B細胞和Met-5A細胞DNA的損傷
        1.3.4 YO-PRO-1和PI聯(lián)合染色定量檢測細胞凋亡
        1.3.5 熒光探針DCFH-DA檢測細胞內ROS的產生
        1.3.6 DHR123檢測細胞線粒體內ROS水平
        1.3.7 PARP-1、APE/Ref-1、caspase-3和caspase-9基因mRNA表達水平
        1.3.8 PARP-1、APE/Ref-1、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平
        1.3.9 抗氧化劑NAC對細胞DNA損傷、凋亡和ROS的抑制作用
    1.4 討論
第二部分 PARP-1和APE/Ref-1缺陷細胞株的構建
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 實驗方法
    2.3 研究結果
        2.3.1 質粒陽性克隆鑒定
        2.3.2 慢病毒滴度測定
        2.3.3 目的細胞轉染效率
        2.3.4 PARP-1敲除和APE/Ref-1敲除慢病毒載體效能鑒定
    2.4 討論
第三部分 PARP-1和APE/Ref-1抑制在溫石棉及其替代品致細胞損傷中的作用
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
    3.3 研究結果
        3.3.1 細胞活力測定
        3.3.2 PARP-1和APE/Ref-1在溫石棉及替代品致細胞凋亡中的作用
        3.3.3 PARP-1和APE/Ref-1在溫石棉及替代品致細胞DNA損傷中作用
    3.4 討論
參考文獻
綜述
    參考文獻
作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果

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