抗BoHV-1單克隆抗體制備及gD蛋白抗原表位鑒定
發(fā)布時(shí)間：2020-12-03 17:23
牛傳染性鼻氣管炎病毒（Bovine Infectious Rhinotracheitis Virus,IBRV）又稱為是BoHV-1,是牛傳染性鼻氣管炎（Bovine Infectious Rhinotracheitis,IBR）的病原體,也是引起牛呼吸道疾病的重要病毒性病原之一。BoHV-1感染除引起呼吸道炎癥外,還可引起結(jié)膜炎、流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等。此外,BoHV-1具有三叉神經(jīng)節(jié)潛伏感染周期性激活的特點(diǎn),導(dǎo)致牛傳染病鼻氣管炎（IBR）清除難度較大,影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)的商品化疫苗具有潛在的風(fēng)險(xiǎn),所以研制出新型疫苗及抗體診斷制劑,對(duì)IBR的防治具有積極的意義。本研究對(duì)BoHV-1 Barthanu/67株進(jìn)行超速離心濃縮作為免疫原,腹腔免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,采用間接免疫熒光方法篩選獲得2株單克隆抗體并制備腹水,分別命名為3C1和4F3。亞類鑒定2株單抗重鏈分別為IgGl和IgA,輕鏈均為kappa鏈;間接免疫熒光方法測(cè)定上清及腹水效價(jià),單抗3C1效價(jià)分別為1:40和1:12 800,單抗4F3效價(jià)分別為1:40和1:3200;經(jīng)間接免疫熒光和Western blot...
【文章來(lái)源】： 賈曉雪 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
BoHV-1蛋白結(jié)構(gòu)(EricB,1996)
抗BoHV-1單克隆抗體的制備及鑒定212.2.6.2MAb中和活性的測(cè)定DMEM將單抗從1:100倍稀釋，連續(xù)2倍稀釋的3C1細(xì)胞培養(yǎng)上清與100個(gè)TCID50的BoHV-1病毒混合，于37℃水浴鍋?zhàn)饔?h，將混合液每孔100μL接種到96孔板內(nèi)鋪滿單層的MDBK細(xì)胞上孵育，將只含100個(gè)TCID50/100μL病毒混合液直接鋪于MDBK細(xì)胞內(nèi)設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照和并將DMEM培養(yǎng)基不含單抗上清及接種病毒發(fā)細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照照，于48h后觀察細(xì)胞病變，逐日觀察，120h后判定結(jié)果，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變并作好記錄，按Reed–Muench兩氏法計(jì)算中和效價(jià)。2.2.7單克隆抗體的交叉保護(hù)分析取本實(shí)驗(yàn)室分離并保存保存的以BVDV、BRV、和PRV進(jìn)行Westernblot分析，將對(duì)所獲得的單克隆抗體交叉反應(yīng)進(jìn)行分析。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析2.3.1免疫原的鑒定取經(jīng)超離濃縮的BoHV-1稀釋后與未感染MDBK的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以實(shí)驗(yàn)室制備出的分離制備的BoHV-1牛陽(yáng)性血清為一抗，以HRP-IgG標(biāo)記的兔抗�？贵w為二抗進(jìn)行Westernblot鑒定。結(jié)果顯示，BoHV-1牛陽(yáng)性血清可與超離濃縮的BoHV-1于相對(duì)分子質(zhì)量約55KDa處可見(jiàn)明顯特異性結(jié)合條帶，因抗牛血清為多抗，當(dāng)能與BoHV-1全病毒有明顯反應(yīng)條帶時(shí)即可證明我們制備的免疫原反應(yīng)原性良好。見(jiàn)圖2.1。圖2.1免疫原的鑒定M：Marker；1：BoHV-1超離濃縮病毒；2：未感染BoHV-1的MDBK細(xì)胞Fig.2.1.Identificationofimmunogen1:BoHV-1ultra-isolatedvirus;2:MDBKcellsnotinfectedwithBoHV-1
抗BoHV-1單克隆抗體制備及gD蛋白抗原表位鑒定222.3.2單克隆抗體的制備2.3.2.1雜交瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞融合后，融合后7-10天時(shí)，鏡下觀察，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞團(tuán)見(jiàn)圖2.2。圖2.2融合細(xì)胞團(tuán)Fig.2.2FusionCellCluster2.3.2.2雜交瘤細(xì)胞株的篩選篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔內(nèi)有且僅有一個(gè)細(xì)胞團(tuán)時(shí)，經(jīng)6次亞克隆，通過(guò)IFA篩選最終獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞2株單克隆抗體，分別命名為3C1、4F3。見(jiàn)圖2.3。圖2.3單克隆抗體的熒光分析（200μm）A：?jiǎn)慰寺】贵w3C1；B：?jiǎn)慰寺】贵w4F3；C：BoHV-1未感染的MDBK細(xì)胞Fig.2.3Fluorescenceanalysisofmonoclonalantibodies(200μm)A:Monoclonalantibody3C1;B:Monoclonalantibody4F3;C:BoHV-1uninfectedMDBKcells2.3.3單克隆抗體的生物學(xué)特性分析2.3.3.1亞類鑒定單克隆抗體3C1、4F3根據(jù)Biodragon小鼠單抗亞類鑒定的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行亞類和輕鏈進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示3C1重鏈為IgG1亞類，輕鏈為Kappa鏈;4F3為IgA亞類，輕鏈為Kappa鏈。如圖2.4所示。圖2.4單克隆抗體的亞類鑒定Fig.2.4Identificationofsubclassesofmonoclonalantibodies
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]河北省奶牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 陳穎彬,常麗云,李林,王紫燕,趙越,康茜,趙月蘭,秦建華. 黑龍江畜牧獸醫(yī). 2019(13)
[2]牛傳染性鼻氣管炎病毒恒溫隔絕式熒光PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 張穎慧,岳華,湯承,黃建德. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(06)
[3]牛傳染性鼻氣管炎疫苗研究進(jìn)展[J]. 劉瑞寧,鄧明亮,劉玉輝,陳穎鈺,郭愛(ài)珍. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2016(02)
[4]牛傳染性鼻氣管炎病毒gE基因SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 孫志明,周偉光,陳玉惠,高晶,希尼尼根,關(guān)平原. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2012(03)
[5]牦牛病毒性腹瀉/黏膜病和傳染性鼻氣管炎血清學(xué)調(diào)查[J]. 韓志輝,圈華,賀曉龍,魏科峰,額爾德尼扎布. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2010(06)
[6]牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 唐泰山,鄧碧華,王凱民,張常印,雷治海. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2009(04)
[7]牛傳染性鼻氣管炎病毒套式PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 鄧碧華,王凱民,唐泰山,張常印,雷治海. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(06)
[8]牛傳染性鼻氣管炎病毒gG蛋白的表達(dá)及gG-ELISA的建立[J]. 顏邦芬,陳锃,張書(shū)環(huán),林祥梅,陳穎鈺,晁彥杰,李德學(xué),宋念華,陳煥春,郭愛(ài)珍. 生物工程學(xué)報(bào). 2007(05)
[9]利用巢式PCR快速鑒定牛傳染性鼻氣管炎[J]. 楊少華,王長(zhǎng)法,高運(yùn)東,劉文浩,李彥芹,仲躋峰. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào). 2007(04)
[10]牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因的截短表達(dá)與間接ELISA診斷方法的建立[J]. 李兆利,薛飛,朱遠(yuǎn)茂,王延輝. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2006(12)
博士論文
[1]雞傳染性支氣管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D]. 鄒年莉.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
碩士論文
[1]牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體的制備及阻斷ELISA方法的建立[D]. 向文杰.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[2]美洲型PRRSV GP4蛋白中和單抗的制備及其抗原表位鑒定[D]. 劉夢(mèng)瑩.福建農(nóng)林大學(xué) 2019
[3]豬偽狂犬病病毒HeN1株gB蛋白單克隆抗體制備及B細(xì)胞線性表位鑒定[D]. 趙微.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2018
[4]牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白gD單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA的建立[D]. 周躍輝.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2015
[5]牛傳染性鼻氣管炎病毒分離鑒定及其單克隆抗體制備[D]. 王延濤.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2008
本文編號(hào)：2896456
【文章來(lái)源】： 賈曉雪 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
BoHV-1蛋白結(jié)構(gòu)(EricB,1996)
抗BoHV-1單克隆抗體的制備及鑒定212.2.6.2MAb中和活性的測(cè)定DMEM將單抗從1:100倍稀釋，連續(xù)2倍稀釋的3C1細(xì)胞培養(yǎng)上清與100個(gè)TCID50的BoHV-1病毒混合，于37℃水浴鍋?zhàn)饔?h，將混合液每孔100μL接種到96孔板內(nèi)鋪滿單層的MDBK細(xì)胞上孵育，將只含100個(gè)TCID50/100μL病毒混合液直接鋪于MDBK細(xì)胞內(nèi)設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照和并將DMEM培養(yǎng)基不含單抗上清及接種病毒發(fā)細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照照，于48h后觀察細(xì)胞病變，逐日觀察，120h后判定結(jié)果，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變并作好記錄，按Reed–Muench兩氏法計(jì)算中和效價(jià)。2.2.7單克隆抗體的交叉保護(hù)分析取本實(shí)驗(yàn)室分離并保存保存的以BVDV、BRV、和PRV進(jìn)行Westernblot分析，將對(duì)所獲得的單克隆抗體交叉反應(yīng)進(jìn)行分析。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析2.3.1免疫原的鑒定取經(jīng)超離濃縮的BoHV-1稀釋后與未感染MDBK的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以實(shí)驗(yàn)室制備出的分離制備的BoHV-1牛陽(yáng)性血清為一抗，以HRP-IgG標(biāo)記的兔抗�？贵w為二抗進(jìn)行Westernblot鑒定。結(jié)果顯示，BoHV-1牛陽(yáng)性血清可與超離濃縮的BoHV-1于相對(duì)分子質(zhì)量約55KDa處可見(jiàn)明顯特異性結(jié)合條帶，因抗牛血清為多抗，當(dāng)能與BoHV-1全病毒有明顯反應(yīng)條帶時(shí)即可證明我們制備的免疫原反應(yīng)原性良好。見(jiàn)圖2.1。圖2.1免疫原的鑒定M：Marker；1：BoHV-1超離濃縮病毒；2：未感染BoHV-1的MDBK細(xì)胞Fig.2.1.Identificationofimmunogen1:BoHV-1ultra-isolatedvirus;2:MDBKcellsnotinfectedwithBoHV-1
抗BoHV-1單克隆抗體制備及gD蛋白抗原表位鑒定222.3.2單克隆抗體的制備2.3.2.1雜交瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞融合后，融合后7-10天時(shí)，鏡下觀察，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞團(tuán)見(jiàn)圖2.2。圖2.2融合細(xì)胞團(tuán)Fig.2.2FusionCellCluster2.3.2.2雜交瘤細(xì)胞株的篩選篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔內(nèi)有且僅有一個(gè)細(xì)胞團(tuán)時(shí)，經(jīng)6次亞克隆，通過(guò)IFA篩選最終獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞2株單克隆抗體，分別命名為3C1、4F3。見(jiàn)圖2.3。圖2.3單克隆抗體的熒光分析（200μm）A：?jiǎn)慰寺】贵w3C1；B：?jiǎn)慰寺】贵w4F3；C：BoHV-1未感染的MDBK細(xì)胞Fig.2.3Fluorescenceanalysisofmonoclonalantibodies(200μm)A:Monoclonalantibody3C1;B:Monoclonalantibody4F3;C:BoHV-1uninfectedMDBKcells2.3.3單克隆抗體的生物學(xué)特性分析2.3.3.1亞類鑒定單克隆抗體3C1、4F3根據(jù)Biodragon小鼠單抗亞類鑒定的試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行亞類和輕鏈進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示3C1重鏈為IgG1亞類，輕鏈為Kappa鏈;4F3為IgA亞類，輕鏈為Kappa鏈。如圖2.4所示。圖2.4單克隆抗體的亞類鑒定Fig.2.4Identificationofsubclassesofmonoclonalantibodies
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]河北省奶牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 陳穎彬,常麗云,李林,王紫燕,趙越,康茜,趙月蘭,秦建華. 黑龍江畜牧獸醫(yī). 2019(13)
[2]牛傳染性鼻氣管炎病毒恒溫隔絕式熒光PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 張穎慧,岳華,湯承,黃建德. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(06)
[3]牛傳染性鼻氣管炎疫苗研究進(jìn)展[J]. 劉瑞寧,鄧明亮,劉玉輝,陳穎鈺,郭愛(ài)珍. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2016(02)
[4]牛傳染性鼻氣管炎病毒gE基因SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 孫志明,周偉光,陳玉惠,高晶,希尼尼根,關(guān)平原. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2012(03)
[5]牦牛病毒性腹瀉/黏膜病和傳染性鼻氣管炎血清學(xué)調(diào)查[J]. 韓志輝,圈華,賀曉龍,魏科峰,額爾德尼扎布. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2010(06)
[6]牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 唐泰山,鄧碧華,王凱民,張常印,雷治海. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2009(04)
[7]牛傳染性鼻氣管炎病毒套式PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 鄧碧華,王凱民,唐泰山,張常印,雷治海. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(06)
[8]牛傳染性鼻氣管炎病毒gG蛋白的表達(dá)及gG-ELISA的建立[J]. 顏邦芬,陳锃,張書(shū)環(huán),林祥梅,陳穎鈺,晁彥杰,李德學(xué),宋念華,陳煥春,郭愛(ài)珍. 生物工程學(xué)報(bào). 2007(05)
[9]利用巢式PCR快速鑒定牛傳染性鼻氣管炎[J]. 楊少華,王長(zhǎng)法,高運(yùn)東,劉文浩,李彥芹,仲躋峰. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào). 2007(04)
[10]牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因的截短表達(dá)與間接ELISA診斷方法的建立[J]. 李兆利,薛飛,朱遠(yuǎn)茂,王延輝. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2006(12)
博士論文
[1]雞傳染性支氣管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D]. 鄒年莉.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
碩士論文
[1]牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體的制備及阻斷ELISA方法的建立[D]. 向文杰.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[2]美洲型PRRSV GP4蛋白中和單抗的制備及其抗原表位鑒定[D]. 劉夢(mèng)瑩.福建農(nóng)林大學(xué) 2019
[3]豬偽狂犬病病毒HeN1株gB蛋白單克隆抗體制備及B細(xì)胞線性表位鑒定[D]. 趙微.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2018
[4]牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白gD單抗制備及其抗原表位鑒定與雙抗夾心ELISA的建立[D]. 周躍輝.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2015
[5]牛傳染性鼻氣管炎病毒分離鑒定及其單克隆抗體制備[D]. 王延濤.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2008
本文編號(hào)：2896456
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