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VEGF、p53在精原細(xì)胞瘤中的表達(dá)及相關(guān)性分析

發(fā)布時(shí)間:2014-07-30 18:04

  精原細(xì)胞瘤起源于原始生殖細(xì)胞,是睪丸最常見(jiàn)的惡性腫瘤,約占30% ~40% ,好發(fā)年齡為35~45歲? 。早期精原細(xì)胞瘤手術(shù)簡(jiǎn)單,術(shù)后輔助以放療和化療,90% 能痊愈,晚期發(fā)現(xiàn)則療效差,死亡率高。因此早期發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞瘤對(duì)提高患者的生存率、治愈率起著極其關(guān)鍵的作用。目前許多學(xué)者開(kāi)始關(guān)注基因達(dá)學(xué)方法來(lái)早期診斷精原細(xì)胞瘤,并研究精原細(xì)胞瘤相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)功能、達(dá)與突變以及多基因之間的相互聯(lián)系,對(duì)于揭示精原細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,探索臨床早期診斷的分子標(biāo)記和治療靶點(diǎn)以及預(yù)后評(píng)價(jià)等都具有十分重要的意義。本文運(yùn)用免疫組化S-P法和PCR.單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)法,以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、p53基因來(lái)探索精原細(xì)胞瘤診斷和治療的新思路、新方法。

  1 材料與方法

  1.1 病例和標(biāo)本38例精原細(xì)胞瘤病例選自1991至2007年外科手術(shù)根治標(biāo)本,主要來(lái)自江蘇省人民醫(yī)院、延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院、江蘇省蘇北人民醫(yī)院和揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院存檔睪丸精原細(xì)胞瘤蠟塊。按照WHO(2004)睪丸腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)揚(yáng)州市病理診斷中心再次病理核實(shí)為精原細(xì)胞瘤。根據(jù)睪丸腫瘤臨床分期標(biāo)準(zhǔn) 將精原細(xì)胞瘤統(tǒng)一進(jìn)行臨床分期,I期:腫瘤局限于睪丸,沒(méi)有腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況;1I期:腫瘤轉(zhuǎn)移至腹膜后淋巴結(jié);111期:有膈上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,或淋巴結(jié)外轉(zhuǎn)移(肺,肝,腦,骨)。其中I期15例;II期11例,Ⅲ期12例。對(duì)照用正常睪丸組織10例,來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室尸檢標(biāo)本。

  1.2 試劑和方法二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。采用免疫組化(S-P)法染色,所用一抗VEGF、p53及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(streptavidin—peroxidase,SP)試劑盒均購(gòu)自購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。按S-P試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每批染色均設(shè)陰性空白對(duì)照(以PBS液代替一抗)。

  p53引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。首先提取精原細(xì)胞瘤DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再配制2%的瓊脂糖凝膠,對(duì)p53基因5、6、7、8外顯子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,采用PCR.SSCP分析對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行p53基因突變的檢測(cè)和判斷。

  1.3 結(jié)果判定高倍鏡下隨機(jī)觀察記數(shù)10個(gè)高倍視野(×200)中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù),根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和顯色強(qiáng)度分為:(一),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于5%或無(wú)陽(yáng)性物質(zhì)的表達(dá);(+),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5% ~25%或顯色淺;(++),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25% ~50%或顯色深;(+++),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于50%及顯色深。

  1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0及EXCEL 2003軟件進(jìn)行分析,組間比較選用x 檢驗(yàn),VEGF和p53表達(dá)的相關(guān)性分析選用Spearman等級(jí)相關(guān)比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

  2 結(jié) 果

  2.1 VEGF在精原細(xì)胞瘤中的表。

  2.2 p53陽(yáng)性在精原細(xì)胞瘤中細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)。

  2.3 VEGF和p53的相關(guān)檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)(r)=0.183(P>0.05),VEGF和p53表達(dá)之間無(wú)相關(guān)。

  2.4 p53在精原細(xì)胞瘤中突變的檢測(cè)結(jié)果選取11例精原細(xì)胞瘤標(biāo)本,p53基因突變的有5例,突變率為45.45% ,其中第5外顯子突變的有3例、第7外顯子突變的有1例、第8外顯子突變的有1例。

  3 討論

  3.1 精原細(xì)胞瘤中VEGF的表達(dá) 1989年Ferrara等 在體外培養(yǎng)的牛垂體細(xì)胞中分離出一種糖蛋白,它在體內(nèi)外都表現(xiàn)出特異性的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)血管生成的作用,因此稱之為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。VEGF在許多腫瘤中都有過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象,國(guó)內(nèi)外許多報(bào)道表明,VEGF與精原細(xì)胞瘤之間關(guān)系密不可分。Restucci等 經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出在精原細(xì)胞瘤中,VEGF的表達(dá)以及微血管的密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織,在轉(zhuǎn)移的精原細(xì)胞瘤中VEGF的表達(dá)和微血管的密度也高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的精原細(xì)胞瘤。

  本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)精原細(xì)胞瘤臨床分期,檢測(cè)VEGF在精原細(xì)胞瘤各期中的表達(dá)情況顯示:I期與Ⅱ期、I期與Ⅲ期兩組間比較有顯著差異(P<0.05),Ⅱ期與Ⅲ期之間比較無(wú)顯著差異(P>0.05);精原細(xì)胞瘤與正常對(duì)照組織之間比較有顯著差異(P<0.01)。由此可見(jiàn),VEGF隨著精原細(xì)胞瘤臨床分期的進(jìn)展,陽(yáng)性表達(dá)率也越來(lái)越高,雖然Ⅱ期與Ⅲ期之間比較無(wú)明顯差異,但仍然可以看到表達(dá)量的遞增趨勢(shì)。而正常睪丸組織中VEGF陽(yáng)性的例數(shù)少,且表達(dá)量顯著低于腫瘤組織。此外本文亦發(fā)現(xiàn)VEGF在精原細(xì)胞瘤的腫瘤血管中大部分都表現(xiàn)出明顯陽(yáng)性,提示VEGF在精原細(xì)胞瘤的發(fā)生和臨床進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。由此推測(cè),精原細(xì)胞瘤中腫瘤細(xì)胞的快速增殖在局部形成一個(gè)相對(duì)缺氧的微環(huán)境,缺氧反過(guò)來(lái)促進(jìn)VEGF的分泌,進(jìn)而促使腫瘤血管生成、微血管通透性增加,為腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步增殖提供營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ),筆耕論文新浪博客,從而形成一個(gè)惡性循環(huán)。由此不難得出:VEGF不僅反映了精原細(xì)胞瘤中血管的生成能力,而且與其惡性進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān),提示VEGF是一個(gè)良好的反映睪丸精原細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的指標(biāo)之一,如果能在精原細(xì)胞瘤發(fā)生的早期敲除VEGF基因,似乎可以明顯延緩甚至停止精原細(xì)胞瘤的發(fā)展,當(dāng)然這種方法還需繼續(xù)研究。

  3.2 精原細(xì)胞瘤中p53的表達(dá)和變異p53基因是研究最為廣泛深入的腫瘤相關(guān)基因,在50% ~60% 的人類各系統(tǒng)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。p53被稱為“基因組衛(wèi)士”,其主要生物學(xué)功能是維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

  p53基因極其容易突變,Lewis等報(bào)道p53陽(yáng)性表達(dá)在精原細(xì)胞瘤中為90% ,在正常的睪丸組織中不表達(dá),且在精原細(xì)胞瘤中p53隨著腫瘤的臨床分期增加而下降。Eid等¨ 報(bào)道p53基因在精原細(xì)胞瘤和胚胎性癌中陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng),p53表達(dá)在腫瘤臨床早期最高,到后期反而降低。

  本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),p53在精原細(xì)胞瘤臨床分期I期中的表達(dá)率達(dá)到93.33% ,1I期與Ⅲ期的表達(dá)率分別為54.55%和50% 。與前人結(jié)果比較一致,證明p53在精原細(xì)胞瘤發(fā)生的早期起著非常重要的作用。由此推斷:精原細(xì)胞瘤在剛剛發(fā)生時(shí),p53起著很重要的作用,隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展,p53的作用逐漸減弱,最后在精原細(xì)胞瘤的晚期僅起很微弱的作用,甚至起不到促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。因此可提示,監(jiān)測(cè)p53基因可以反映精原細(xì)胞瘤臨床早期的生物學(xué)行為,可用以早期發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞瘤,若早期敲除突變的p53基因或避免p53基因發(fā)生突變,似可為延緩精原細(xì)胞瘤的發(fā)展起到一定作用。

  本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p53的5號(hào)外顯子有3例突變,7號(hào)有1例突變,8號(hào)有1例突變,p53基因突變率為45.45% ;5例突變中有4例是處于臨床分期I期,1例處于Ⅱ期,說(shuō)明從某種程度上可以認(rèn)為p53在精原細(xì)胞瘤的早期容易發(fā)生突變,在精原細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,p53在早期起較大作用。

  3.3 精原細(xì)胞瘤中VEGF的表達(dá)與p53的關(guān)系關(guān)于精原細(xì)胞瘤中VEGF與p53相關(guān)性的研究較少,本實(shí)驗(yàn)將VEGF與p53進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)兩者并無(wú)相關(guān)性,反而發(fā)現(xiàn)VEGF在精原細(xì)胞瘤的發(fā)展中呈遞增趨勢(shì),而p53僅僅在精原細(xì)胞瘤的發(fā)生早期起作用。由此說(shuō)明,與兩者相關(guān)的基因在精原細(xì)胞瘤中沒(méi)有明顯的協(xié)同作用,在精原細(xì)胞瘤中并不存在一條p53直接調(diào)節(jié)VEGF的通路,VEGF可能不受p53的直接調(diào)節(jié)。

 



本文編號(hào):4611

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