向日葵銹病(Puccinia helianthi Schw.)是向日葵重要病害之一,嚴重危害向日葵的品質(zhì)及含油量。向日葵銹菌分泌的胞外蛋白酶是其致病因子之一,這種蛋白酶破壞植物細胞外部保護屏障,有利于病菌侵入,導(dǎo)致寄主感病。本研究基于前期實驗室對向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分泌蛋白的篩選,從中挑出一條表達量較高的基因(KU994904)進行分析,首先進行該基因生物信息學(xué)分析,以確定它的主要的功能,命名為金屬蛋白酶(metalloproteinase,mep),其次克隆了該金屬蛋白酶基因,構(gòu)建相關(guān)原核載體進行體外表達,同時對其亞細胞定位,確定其主要作用位點,為實驗室今后進一步研究該蛋白的致病機制奠定了基礎(chǔ)。主要取得以下結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析。該金屬蛋白酶成熟基因序列長1335bp,編碼445個氨基酸,利用在線軟件 SignalP4.1 Server、TMpred、big-PI predictor 及 TargetP 1.1 確定此蛋白酶為胞外分泌蛋白,通過NCBI進行比對,其與M36家族中5條序列具有較高相似性,并利用SWISS-MODEL基于同源建模的方法檢索PDB(protein data ...

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 向日葵種植情況
    1.2 向日葵銹病發(fā)生與發(fā)布
    1.3 向日葵銹病侵染循環(huán)
    1.4 病原菌的致病機制
    1.5 病原菌分泌酶類物質(zhì)
        1.5.1 蛋白酶
        1.5.2 真菌蛋白酶
        1.5.3 金屬蛋白酶
    1.6 生物信息學(xué)
    1.7 本研究的目的及意義
2 向日葵銹菌胞外分泌蛋白生物信息學(xué)分析
    2.1 數(shù)據(jù)來源
    2.2 生物信息學(xué)分析
        2.2.1 蛋白序列及特征性分析
        2.2.2 蛋白疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、GPI錨定位點及亞細胞定位分析
        2.2.3 蛋白二三級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 蛋白酶基因序列篩選及特征性分析
        2.3.2 蛋白酶疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、GPI錨定位點及亞細胞定位分析
        2.3.3 蛋白二三級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域預(yù)測
    2.4 結(jié)論與討論
3 金屬蛋白酶原核表達
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基的配制
        3.1.5 向日葵銹病菌RNA提取
        3.1.6 cDNA的合成
        3.1.7 基因擴增
        3.1.8 PCR產(chǎn)物純化
        3.1.9 回收產(chǎn)物與克隆載體連接
        3.1.10 感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        3.1.11 重組質(zhì)粒的篩選
        3.1.12 重組質(zhì)粒的提取與驗證
        3.1.13 目的基因和表達載體pET30a連接
        3.1.14 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達
        3.1.15 菌液放大培養(yǎng)
        3.1.16 蛋白純化
        3.1.17 親和層析純化蛋白
        3.1.18 分子篩層析(SEC)純化蛋白
        3.1.19 Bradford測定蛋白濃度
        3.1.20 Western-blot檢測蛋白
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 蛋白酶基因擴增及克隆載體構(gòu)建
        3.2.2 蛋白酶基因表達載體構(gòu)建
        3.2.3 SDS-PAGE分析鑒定誘導(dǎo)表達結(jié)果
        3.2.4 蛋白純化
    3.3 結(jié)論與討論
4 金屬蛋白酶亞細胞定位
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要儀器
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 基因擴增
        4.1.5 目的基因與克隆載體連接
        4.1.6 表達載體構(gòu)建
        4.1.7 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞制備
        4.1.8 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化
        4.1.9 煙草瞬時表達
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 金屬蛋白酶表達載體構(gòu)建
        4.2.2 金屬蛋白酶成熟基因的煙草瞬時表達
    4.3 結(jié)論與討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
作者簡介



本文編號：4056491