RNA甲基化作為一種表觀遺傳標(biāo)記,在基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。至今為止,已發(fā)現(xiàn)RNA存在著100多種修飾,其中甲基化是主要的修飾形式,6-甲基腺嘌呤(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)是最具有代表性的兩種甲基化修飾。有研究表明RNAm5C修飾在生物體的發(fā)育以及癌癥的發(fā)生中起重要作用。最初被認(rèn)為是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的TRDMT1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1)近十年來被證實(shí)是RNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶,催化tRNA產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶修飾。最近有研究發(fā)現(xiàn)TRDMT1基因?qū)ζ鞴傩纬�、生物體的發(fā)育以及疾病的發(fā)生有影響。然而,對TRDMT1調(diào)控這些過程的分子機(jī)制尚不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的同源重組技術(shù)在RNA甲基化酶TRDMT1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上敲入轉(zhuǎn)錄終止序列BGH ploy(A),終止TRDMT1的表達(dá)從而達(dá)到敲除的目的。通過構(gòu)建TRDMT1敲除的HEK293細(xì)胞系,研究TRDMT1去表達(dá)對細(xì)胞表型以及其他基因表達(dá)的影響,從而了解TRDMT1基因的功能,為研究RNAm5C甲基化的功能提供新思路。主要的研究方法與結(jié)果如下:1、建...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９系統(tǒng)的作用原理（引用）??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ??

被改編為一個基因編輯工具，改造后的系統(tǒng)包含兩部分：向?qū)В遥危?（ｓｉｎｇｌｅ?ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，??ｓｇＲＮＡ）和Ｃａｓ９蛋白。ｓｇＲＮＡ是人工合成的一段能夠識別目標(biāo)序列的ＲＮＡ序列，其中包??含招募Ｃａｓ９蛋白的ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ復(fù)合體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。作用原理如圖１－１....

圖２－１?ｇＲＮＡ和檢測引物位置示意圖??．－

２．２．１獲得同源重組片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ??利用ＰＣＲ的方法在Ｐｕｒｏ－ＢＧＨ?ｐｏｌｙ?（Ａ）片段５’端添加Ｔ２Ａ和ＬＯＸＮ序列，構(gòu)建同源??重組片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ?（圖２－２）。以ｐＳＭＰＵＷ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ載體為模板，使用高保真酶（Ｐｈａｎｔａ？??Ｓｕｐｅｒ－....

圖2-2LC)RN-Pwo結(jié)構(gòu)以及PCR引物位置示意圖

圖２－１?ｇＲＮＡ和檢測引物位置示意圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｇＲＮＡ?ａｎｄ?ｐｒｉｍｅｒ?ｐｏｓｉｔｉｏｎ??２．２構(gòu)建ＴＲＤＭＴｌ－ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ同源重組載體??２．２．１獲得同源重組片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ??利用ＰＣＲ的方法在Ｐｕ....

圖２－３?ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ結(jié)構(gòu)以及ＰＣＲ引物位置示意圖??

?２．２．２擴(kuò)增左端同源臂ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ??利用引物擴(kuò)增靶位點(diǎn)左端同源臂ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ?（圖２－３）。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：??（１）

本文編號：4000069