發(fā)布時間：2020-11-18 19:02

　　 背景和目的:肺癌是常見的惡性腫瘤之一,非小細胞肺癌占85%。目前治療包括手術(shù)切除、鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療、放療及靶向治療,但肺癌發(fā)生機制不完全清楚。因此,探索新的關(guān)鍵分子,對明確肺癌發(fā)生機制及靶向治療有重要意義。甘氨酸脫羧酶(glycine decarboxylase,GLDC)是連接甘氨酸代謝與腫瘤發(fā)生的代謝致癌基因,在腫瘤干細胞豐富的原發(fā)性非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中過度表達,可以驅(qū)動NSCLC腫瘤干細胞,另外腫瘤干細胞的生長和致瘤能力都依賴于高水平GLDC的表達,因此GLDC可以作為干細胞表面標志物來識別腫瘤干細胞。目前GLDC已出現(xiàn)在多種腫瘤中,非小細胞肺癌尤為突出,與患者預(yù)后呈正相關(guān)�；�因選擇性剪接(alternative splicing,AS)是人類基因調(diào)控最常見的機制之一,在腫瘤的生理過程和細胞發(fā)育過程中至關(guān)重要,但GLDC在NSCLC中的選擇剪切調(diào)控機制迄今未見報道,因而了解GLDC剪接體生物學作用及功能可以為今后腫瘤的早期診斷和治療奠定理論基礎(chǔ)。本實驗旨在克隆人GLDC基因可變剪接體,分析生物學活性,為非小細胞肺癌發(fā)生機制及靶向治療提供指導意義。方法:1.構(gòu)建克隆載體:在NCBI中查找人的GLDC全長(glycine decarboxylase full length,GLDCfl)及其剪接體GLDC varient1(GLDCV1)序列,根據(jù)其cDNA設(shè)計引物,通過RT-PCR結(jié)合測序的方法檢測人肺腺癌細胞A549及正常細胞MRC5中GLDCfl及GLDCV1 mRNA的表達并對其進行擴增;同時在MRC5細胞中過表達GLDCfl及GLDCV1,蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染后蛋白表達;2.體外功能實驗:用MTT法檢測過表達對MRC5細胞活力的影響,BrdU、平板克隆、瓊脂克隆形成實驗檢測對細胞增殖能力影響,RT-PCR檢測過表達對干性基因標志物CD44、ALDH1的影響,同時驗證是否影響乳酸生成;3.體內(nèi)功能實驗:用GLDCfl及GLDCV1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MRC5細胞,篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞后注入裸鼠皮下,以空載質(zhì)粒為陰性對照,觀察成瘤能力;4.用篩選好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞驗證過表達對腫瘤相關(guān)信號通路PI3K/AKT、JAK/STAT、ERK/MAPK通路蛋白表達的影響,同時驗證對細胞周期蛋白表達的影響。結(jié)果:1.A549和MRC5中GLDCfl及剪接體GLDCV1在RNA水平均存在,蛋白印跡法顯示蛋白水平僅A549表達;2.在體外將GLDCfl及剪接體GLDCV1過表達于MRC5細胞,48h后用MTT法檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞活力增加;BrdU、瓊脂克隆及平板克隆實驗證明過表達會促進MRC5細胞的增殖;RT-PCR檢測干細胞標志物顯示過表達促進CD44和ALDH1表達;轉(zhuǎn)染24h后檢測乳酸生成增多;3.體內(nèi)荷瘤實驗證明穩(wěn)轉(zhuǎn)GLDCV1剪接體在裸鼠體內(nèi)具有致瘤性;4.對過表達促進細胞增殖的機制進行研究,發(fā)現(xiàn)過表達會使ERK/MAPK信號通路上P-ERK、P-P38蛋白表達增多,說明過表達可能通過ERK/MAPK信號通路發(fā)揮促進細胞增殖的作用。同時過表達還可以使CyclinD1表達增多。結(jié)論:1.本研究分析了GLDC基因選擇性剪接體在腫瘤細胞中的表達形式,并揭示了GLDC及其變體在非小細胞肺癌中的生物學作用。2.通過在MRC5中過表達GLDCfl及其剪接體GLDCV1證明過表達對MRC5的細胞活力、增殖能力、克隆形成能力、干細胞標志物、乳酸生成及成瘤能力均有促進作用。3.發(fā)現(xiàn)過表達可能通過ERK/MAPK信號通路發(fā)揮促進細胞增殖的作用。4.過表達GLDCfl及其剪接體GLDCV1會通過影響CyclinD1的表達促進細胞增殖。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

第 4 章 實驗結(jié)果.1 GLDC 基因選擇性剪接變體在非小細胞肺癌中的存在形式實驗前期首次發(fā)現(xiàn)了 GLDCV1 的存在，為了初步判斷 GLDC 基因選擇性變體在非小細胞肺癌中的存在形式，利用 RT-PCR 的方法，在人正常肺細RC5 和人非小細胞肺癌細胞 A549 中進行基因擴增，根據(jù)前期實驗顯示，在子 1 和 6 的位置設(shè)計引物即擴增 406-1039 片段更容易鑒別和擴增出全LDCfl。遂針對片段 1-1039 和 406-1039 擴增 GLDCV1 和 GLDCfl 的引物。結(jié)果如下圖 4.1 所示，在癌細胞和正常細胞中均可以擴增出與預(yù)期片段大小的片段。對片段進行膠回收測序，顯示 GLDCfl 與原報道中的相同，GLDC缺失 49-448 之間 400bp 長度的片段。

2 GLDC 蛋白在非小細胞肺癌 A549 及正常肺 MR蛋白表達情況DC 及其變體的生物學作用研究過表達載體載體的構(gòu)建由金唯智公司完成，所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn) blot 的方法檢測質(zhì)粒表達情況，結(jié)果如下圖 4.3 所V1 在 MRC5 細胞中的表達增高。

GLDC 蛋白在非小細胞肺癌 A549 及正常肺 MRC蛋白表達情況C 及其變體的生物學作用研究過表達載體載體的構(gòu)建由金唯智公司完成，所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染 lot 的方法檢測質(zhì)粒表達情況，結(jié)果如下圖 4.3 所示V1 在 MRC5 細胞中的表達增高。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉東,李奕,張道榮;p~(21)~(WAF1)及CyclinE在非小細胞肺癌中的表達及意義[J];實用腫瘤學雜志;2002年04期

本文編號：2889082