發(fā)布時間：2020-11-18 12:15

　　 以蘋果酸為主的有機(jī)酸在蘋果果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)中起到重要作用,解析蘋果果實(shí)中蘋果酸積累的遺傳和分子機(jī)理,對優(yōu)質(zhì)育種和果實(shí)品質(zhì)調(diào)控具有重要的意義。本試驗(yàn)利用'紅玉' X '金冠'和紫塞明珠' × '紅富士'等雜種群體分別對蘋果果實(shí)蘋果酸含量進(jìn)行MapQTL和BSA-seq分析,然后在主效QTLs區(qū)間內(nèi)預(yù)測候選基因并進(jìn)行變異位點(diǎn)功能驗(yàn)證,最終建立基因組選擇模型。主要研究結(jié)果如下:1.通過對'紫塞明珠' X '紅富士'正反交群體、'紫塞明珠,× '金冠'正反交群體以及'紅玉' X '金冠'群體5個雜交群體連續(xù)3年的表型進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)蘋果果實(shí)酸性狀為典型的數(shù)量性狀,雜交后代中性狀分離廣泛,其廣義遺傳力均在80%以上,變異主要由遺傳效應(yīng)決定。2.利用'紅玉' × '金冠'和'紫塞明珠' × '紅富士'雜交群體,分別用MapQTL和BSA-seq方法對果實(shí)蘋果酸含量進(jìn)行QTL定位,共獲得4個主效QTLs:qt108.1、qt108.2、qt108.3和qt116.1。通過蘋果參考基因組基因注釋和本實(shí)驗(yàn)室的父母本'紅玉'和'金冠'的重測序庫來預(yù)測篩選候選基因。最終分析結(jié)果為:MdMYB44、MdPP2CH、MdSAAUR37和MdALMTI分別為qtl08.1、qt108.2、qt108.3和qt116.1位點(diǎn)的候選基因。3.我們用已經(jīng)開發(fā)的CAPS標(biāo)記來檢測雜交群體后代和種質(zhì)資源中該基因MdLMTII SNP位點(diǎn)上A/G多態(tài)性。MdALMTII基因型(AA、AG、GG)與果實(shí)蘋果酸含量顯著相關(guān)(P0.01),GG基因型表現(xiàn)為高酸,AA表現(xiàn)為低酸。4.在MdPP2CH基因編碼區(qū)802bp處存在一個A/GSNP位點(diǎn),使編碼蛋白 268位氨基酸從蘇氨酸變?yōu)楸�氨�?T268A)。MdPP2CH基因型(AA、AG、GG)與果實(shí)蘋果酸含量顯著相關(guān)(P0.001),GG基因型個體中的蘋果酸平均含量顯著高于AG基因型,而AG基因型個體中的蘋果酸的平均含量顯著高于AA基因型,表現(xiàn)為加性效應(yīng)。磷酸酶活性驗(yàn)證試驗(yàn)證明當(dāng)氨基酸多態(tài)由Thr變?yōu)锳la時,MdPP2CH的磷酸酶活性下降,說明該SNP位點(diǎn)影響MdPP2CH蛋白脫磷酸化功能。在蘋果愈傷中過表達(dá)MdPP2CH,轉(zhuǎn)基因愈傷中的蘋果酸含量顯著下降,說明MdPP2CH負(fù)調(diào)控蘋果酸的積累。過表達(dá)MdPP2CH(268T)的轉(zhuǎn)基因愈傷中的蘋果酸含量顯著低于過表達(dá)MdPP2CH(268 A),說明當(dāng)氨基酸多態(tài)由Thr變?yōu)锳la時會導(dǎo)致MdPP2CH的磷酸酶活性下降。Y2H和BiFC試驗(yàn)證明MdPP2CH可與蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MdALMTII和離子通道蛋白MdVHA-A3、MdVHA-B2、MdVHA-D2互作,通過脫磷酸化抑制蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性,從而阻礙蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡,負(fù)向調(diào)控蘋果酸的積累。5.在MdSAUR37基因起始編碼子ATG上游-639 bp處有一個36-bp的插入。MdSAUR37基因型(Ⅱ、Ii、ii)與果實(shí)蘋果酸含量顯著相關(guān)(P0.001),插入純合基因型Ⅱ個體中的蘋果酸的含量顯著高于插入雜合基因型Ii,而基因型Ii個體中的蘋果酸的平均含量顯著高于無插入基因型ii。果實(shí)成熟期MdSAUR37基因的表達(dá)水平與果實(shí)中蘋果酸的含量顯著相關(guān)(R2 = 0.7792,P0.001)。GUS染色和GUS/GFP雙標(biāo)簽瞬時表達(dá)檢測分析表明MdSAUR37基因啟動子區(qū)36-bp插入能顯著增強(qiáng)MdSAUR37基因啟動子活性。MdSAUR37可以與MdPP2CH互作并抑制MdPP2CH的脫磷酸化,抑制率達(dá)35%。6.在MdMYB44基因編碼區(qū)起始編碼子ATG上游啟動子區(qū)在-1010 bp位存在一個A/G SNP位點(diǎn)。MdMYB44基因型(AA、AG、GG)與果實(shí)蘋果酸含量顯著相關(guān)(P0.001),基因型GG個體中的蘋果酸的含量顯著高于基因型AG,而基因型AG個體中的蘋果酸的含量顯著高于基因型AA。7.對MdSAUR37/MdPP2CH/MdALMTII/MdMYB44組合基因型進(jìn)行基因分型,通過用蘋果酸含量平均值值為各基因的基因型賦值,經(jīng)迭代運(yùn)算,建立了蘋果酸含量性狀的基因組選擇的線性模型:PPV= GV(MdSAUR37)× GV(MdPP2CH)× GV(MdALMTII)+ GV(MdMYB44)+ 校準(zhǔn)系數(shù)(1)。該模型預(yù)測的蘋果酸表型值PPV與實(shí)測的蘋果酸含量顯著相關(guān)(p0.001)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S661.1
【部分圖文】：

國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文?丨文獻(xiàn)綜入果肉細(xì)胞，同時也有一部分蔗糖被細(xì)胞壁庶糖酶分解為葡萄糖和果糖等己糖，而山梨醇接進(jìn)入果肉細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的蔗糖在蔗糖酶的催化下合成己糖（葡萄糖和果糖等），另外，醇在山梨醇脫氫酶和山梨醇氧化酶的催化下也合成己糖。一部分蔗糖和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)入液泡儲；而在細(xì)胞質(zhì)中的己糖通過糖降解作用合成磷酸烯醇丙酮酸，磷酸稀醇丙酮酸在磷酸稀醇羧化酶（ＰＥＰＣ）的催化下生成草酰乙酸，草酰乙酸再經(jīng)ＮＡＤ－蘋果酸脫氫酶（ＮＡＤ－ＭＤＨ）生成蘋果酸。一部分蘋果酸進(jìn)入線粒體中三羧酸循環(huán)途徑，經(jīng)過電子傳遞和氧化磷酸化并成ＡＴＰ，為其它代謝途徑提供一定的能量；一部分蘋果酸作為生物合成的前體；也有一部酸積累在液泡中，液泡膜上的質(zhì)子泵為蘋果酸等有機(jī)酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供驅(qū)動力（Ｌｉｉｔｇｅ，?１９Ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｓ??????—

Ｍａ２＂?ＭａＪａｔｅ?ｃｈａｎｎｅ，??（ｍａｌａｔｅ，?ｃｉｔｒａｔｅ，?Ｃｌ＇）??圖１－３果實(shí)中液泡有機(jī)酸貯藏機(jī)理（Ｅｔｉｅｎｎｅ?ｅｔａｌ．，?２０１３）??Ｆｉｇ．?１－３?４Ａｃｉｄ?ｔｒａｐ＇?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｖａｃｕｏｌａｒ?ｏｒｇａｎｉｃ?ａｃｉｄ?ｓｔｏｒａｇｅ?ｉｎ?ｆｒｕｉｔ?ｃｅｌｌｓ??３??

?ＣＹＴＯＳＯＬ??ｓｕｃｃｉｎａｔｅ??圖１－２果實(shí)細(xì)胞中蘋果酸和檸檬酸代謝通路（Ｅｔｉｅｎｎｅ?ｅｔａｌ．，?２０１３）??Ｆｉｇ．?１－２?Ｍａｌａｔｅ?ａｎｄ?ｃｉｔｒａｔｅ?ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｐａｔｈｗａｙｓ?ｉｎ?ｆｒｕｉｔ?ｍｅｓｏｃａｒｐ?ｃｅｌｌｓ??Ｈ＋??Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ?４?ＡＴＰ?１?Ｖ－ＡＴＰａｓｅ??????Ｈ＋?Ｖ－ＰＰｉａｓｅ?５??ＰＰｉ－＾Ｅ?４?ｉ?ｙＴ?＾??ｙ＾＾Ｈ＋??Ａ?Ｈ?４?ｐＨ＝５，５－＜??ｔ?△屮＝＋３０?ｍｖ??Ｖａｃｕｏｌｅ?（?Ｈ??ＨＣｉ２＊?Ｘ?Ｍａ２＊?Ｍａ２＇?＾??ＨＣｉ２＜＾＾＾３?＾?２?＞＾ｖ＝〇ｒｔｅｒ??Ｓｙｍｐｏｒｔ?．棚Ｓ?＼??２Ｈ?Ｃｉ，ｒａｔｅ／Ｈｔ?爭?Ｍａ２－??Ｍａ２＂?ＭａＪａｔｅ?ｃｈａｎｎｅ，??（ｍａｌａｔｅ，?ｃｉｔｒａｔｅ，?Ｃｌ＇）??圖１－３果實(shí)中液泡有機(jī)酸貯藏機(jī)理（Ｅｔｉｅｎｎｅ?ｅｔａｌ．，?２０１３）??Ｆｉｇ．?１－３?４Ａｃｉｄ?ｔｒａｐ＇?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｖａｃｕ
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本文編號：2888707