發(fā)布時(shí)間：2018-10-31 12:48

【摘要】：柞蠶是我國特有的泌絲昆蟲,也是重要的以蛹滯育的模式昆蟲,通過蛹滯育以對抗惡劣環(huán)境,使種群得以延續(xù)。滯育期的昆蟲發(fā)育暫時(shí)停止,解除滯育之后,昆蟲會繼續(xù)進(jìn)行生長發(fā)育和繁殖。柞蠶的促前胸腺激素由腦分泌,通過刺激前胸腺分泌蛻皮激素來控制柞蠶的變態(tài)發(fā)育,研究柞蠶促前胸腺激素基因的表達(dá)及調(diào)控對于闡明柞蠶的滯育機(jī)理,也有助于調(diào)控柞蠶的生活環(huán)境來控制滯育的發(fā)生和解除,實(shí)現(xiàn)柞蠶生產(chǎn)的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。本文以河南省一化性柞蠶品種“豫大1號”滯育蛹和遼寧省二化性柞蠶品種“沈黃2號”的5齡幼蟲、蛹及成蟲為材料,采用RT.PCR技術(shù)得到柞蠶促前胸腺激素(ApPTTH)基因,通過生物信息學(xué)分析對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測；利用原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建了ApPTTH的原核表達(dá)載體,成功誘導(dǎo)ApPTTH蛋白的表達(dá)；利用半定量PCR技術(shù),以二化性柞蠶品種“沈黃2號”5齡早期幼蟲的組織為材料,分析了ApPTTH在幼蟲期不同組織中的表達(dá)譜；分別以一化性和二化性柞蠶滯育蛹為材料,每天采用300 Lux照度、光照17h光照條件誘導(dǎo)滯育蛹解除滯育,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測一化性品種“豫大1號”和二化性品種“沈黃2號”滯育蛹在解除滯育過程中蛹腦組織中ApPTTH表達(dá)量,結(jié)果如下。1.利用TA克隆技術(shù)成功克隆了ApPTTH,柞蠶促前胸腺激素ApPTTH的cDNA的ORF長度為666 bp,編碼221個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)等電點(diǎn)PI為8.38,預(yù)測蛋白長度約為25.96kDa。柞蠶PTTH與其它幾種昆蟲的PTTH氨基酸序列同源性在70%以上。2.RT-PCR檢測結(jié)果表明,ApPTTH除了在柞蠶5齡早期幼蟲的腦組織中有表達(dá)以外,在柞蠶5齡早期幼蟲的卵巢組織中也檢測到ApPTTH的表達(dá),而其它組織中則并沒有檢測到ApPTTH的表達(dá)。3.Real-time PCR檢測結(jié)果表明,柞蠶蛹滯育期間ApPTTH在蛹腦組織中的表達(dá)量變化不大,而在解除滯育以及蛹發(fā)育將要進(jìn)入成蟲時(shí)ApPTTH的表達(dá)量上調(diào)而達(dá)到最大值,當(dāng)柞蠶蛹基本完成成蟲發(fā)育接近羽化出成蟲之后ApPTTH的表達(dá)量又開始下降,說明ApPTTH基因的表達(dá)及ApPTTH的合成對滯育蛹解除滯育及成蟲發(fā)育至羽化具有有重要作用。4.將克隆的ApPTTH與表達(dá)載體pEASY(?)-Blunt E1相連接,并轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3)表達(dá)蛋白,純化后制備抗體。從蛹腦中提取蛋白,通過Western-blot檢測,在30 kD左右出現(xiàn)了一條很粗的條帶,該大小與預(yù)測的ApPTTH分子量相同,與抗體相結(jié)合的蛋白就是柞蠶的PTTH蛋白.本研究為進(jìn)一步了解 ApPTTH的作用及與滯育的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Antheraea pernyi is a unique silk insect in China and an important model insect with pupae diapause. The development of diapause is suspended and the insect continues to grow and reproduce after diapause is released. The prothymic hormone of Antheraea pernyi is secreted by the brain, and the metamorphosis and development of Antheraea pernyi are controlled by stimulating the ecdysone of the prethymic gland to study the gene expression of prothymic hormone and its regulation to clarify the diapause mechanism of Antheraea pernyi. It also helps to regulate the living environment of tussah to control the occurrence and release of diapause and to realize the high and stable production of tussah. Based on the diapause pupae of Henan Province Antheraea pernyi cultivar "Yuda 1" and the 5th instar larva, pupae and adult of Liaoning Province, the (ApPTTH) gene of prothymic hormone was obtained by RT.PCR technique. The structure and function were predicted by bioinformatics analysis. The prokaryotic expression vector of ApPTTH was constructed by prokaryotic expression technique, and the expression of ApPTTH protein was induced successfully. Using semi-quantitative PCR technique, the expression profiles of ApPTTH in different larval tissues were analyzed by using the tissue of the 5th instar larva of "Shenhuang No. 2", a diploid Antheraea pernyi cultivar "Shenhuang No. 2". Diapause pupae of Antheraea pernyi were treated with 300 Lux illumination and 17 h light for 17 h, respectively. The expression of ApPTTH in brain tissue of diapause pupae of "Yuda 1" and "Shenhuang 2" diapause pupae was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results were as follows. 1. Using TA cloning technique, the ORF length of ApPTTH cDNA of ApPTTH, was 666 bp, encoding 221 amino acids, the protein isoelectric point PI was 8.38, and the predicted protein length was about 25.96 kDa. The homology of PTTH amino acid sequence between tussah PTTH and other insects was more than 70%. The results of 2.RT-PCR showed that ApPTTH was expressed in the brain of early 5th instar larvae of tussah. The expression of ApPTTH was also detected in ovary tissues of early 5th instar larvae of tussah, but no expression of ApPTTH was detected in other tissues. During diapause, the expression of ApPTTH in pupae brain of tussah did not change much, but the expression of ApPTTH increased to the maximum when diapause was removed and pupae development was about to enter the adult. The expression of ApPTTH began to decrease after the adult development of tussah silkworm pupae was close to the emergence of adult, indicating that the expression of ApPTTH gene and the synthesis of ApPTTH played an important role in relieving diapause and adult development to emergence. 4. The cloned ApPTTH was linked to the expression vector pEASY (?)-Blunt E1 and transformed into the expressed protein of the strain BL21 (DE3). The antibody was prepared after purification. The protein extracted from pupa brain was detected by Western-blot and a coarse band appeared at about 30 kD. The size of the protein was the same as the predicted molecular weight of ApPTTH. The protein bound to the antibody was the PTTH protein of Antheraea pernyi (Antheraea pernyi). This study laid a foundation for further understanding the role of ApPTTH and its relationship with diapause.
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S885.1;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 吳地興;符華兒;梁桂全;盧洪海;;用微型計(jì)算機(jī)進(jìn)行柞蠶品種評比[J];廣西科學(xué)院學(xué)報(bào);1983年01期

2 孫茜;劉朝良;朱保健;劉秋寧;;柞蠶熱休克蛋白70基因的克隆和序列分析[J];激光生物學(xué)報(bào);2011年02期

3 沈孝行;楊洪江;;激光照射培育柞蠶新品種的研究——(Ⅱ)CO_2激光照射育成早熟多絲量柞蠶品種[J];光電子.激光;1987年06期

4 桂慕燕,左正宏,王學(xué)民,陳元霖;RAPD分析在絹絲昆蟲親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用Ⅱ.柞蠶品種間的遺傳差異[J];遺傳;2001年05期

5 李鋒;劉朝良;邵引剛;趙林;湯良文;;柞蠶Dsx基因的體外擴(kuò)增[J];激光生物學(xué)報(bào);2008年03期

6 張波;王林美;葉博;李樹英;趙振軍;范琦;;用cDNA末端擴(kuò)增法克隆柞蠶攻擊素(attacin)基因及序列分析[J];蠶業(yè)科學(xué);2006年03期

7 ;[J];;年期

相關(guān)會議論文 前10條

1 仝振祥;王鳳成;冀萬杰;張博;;主成分分析在柞蠶種質(zhì)資源評價(jià)中的應(yīng)用[A];中國蠶學(xué)會第六屆家蠶和柞蠶遺傳育種學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

2 王鳳成;宿桂梅;赫英姿;仝振祥;;柞蠶不同品種對柞蠶鏈球菌抗性與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)性的初步研究[A];全面建設(shè)小康社會：中國科技工作者的歷史責(zé)任——中國科協(xié)2003年學(xué)術(shù)年會論文集（上）[C];2003年

3 姜義仁;石生林;楊瑞生;夏潤璽;車春娜;秦利;;柞蠶新品種“沈黃2號”選育研究[A];第十屆家（柞）蠶遺傳育種及良種繁育學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

4 靳向東;朱興友;郝大東;任曉義;萬軍;趙先進(jìn);;柞蠶新品種“選大4號”選育初報(bào)[A];第十屆家（柞）蠶遺傳育種及良種繁育學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

5 徐亮;孟憲民;戚利;劉鳳云;宿桂梅;焦陽;;柞蠶雜交種數(shù)量性狀的主成分分析[A];中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集（3）[C];2009年

6 郝大東;朱興友;靳向東;任曉義;萬軍;;柞蠶新品種“永青”選育初告[A];第十屆家（柞）蠶遺傳育種及良種繁育學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

7 趙云吉;;提高柞蠶多元雜交質(zhì)量 促進(jìn)柞蠶生產(chǎn)的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[A];中國蠶學(xué)會第七次全國代表大會論文集[C];2003年

8 仝振祥;王鳳成;;柞蠶不同品種蛹期酯酶同工酶的初步研究[A];全面建設(shè)小康社會：中國科技工作者的歷史責(zé)任——中國科協(xié)2003年學(xué)術(shù)年會論文集（上）[C];2003年

9 朱興友;郝大東;靳向東;任曉義;萬軍;趙先進(jìn);;柞蠶新品種“吉青”選育初報(bào)[A];第十屆家（柞）蠶遺傳育種及良種繁育學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

10 周新鋒;劉勤;洪恩眾;霍錫敏;張勁松;程秋菊;楊瑞生;;高寒地區(qū)柞蠶四元雜交新品種呼雜一號的選育[A];中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集（3）[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 包臣;柞蠶品種選擇及效益分析[N];吉林農(nóng)村報(bào);2009年

2 王德生;遼寧育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)柞蠶品種[N];農(nóng)民日報(bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張從芬;柞蠶小熱休克蛋白的免疫學(xué)功能及其作用機(jī)制研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 劉丹梅;柞蠶新型轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建和精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)化研究[D];大連理工大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 李慧君;柞蠶PTTH基因的克隆及表達(dá)分析[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 姚立虎;柞蠶銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆與表達(dá)分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

3 王磊;柞蠶及家蠶卵黃原蛋白基因的克隆與序列分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

4 陳默;柞蠶線粒體控制區(qū)的結(jié)構(gòu)特征與FK506結(jié)合蛋白基因的表達(dá)譜分析[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

5 李鋒;絹絲昆蟲柞蠶卵黃原基因（Vg）5’端的克隆及序列分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

6 張新民;柞蠶芳香蛋白基因的克隆[D];吉林大學(xué);2007年

7 諶苗苗;野蠶基因組研究Ⅰ[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

，

本文編號：2302239