發(fā)布時(shí)間：2018-02-01 15:21

  本文關(guān)鍵詞： Notch信號(hào)通路 Wnt信號(hào)通路 大腸癌 細(xì)胞增殖 細(xì)胞遷徙 細(xì)胞免疫熒光 裸鼠移植瘤 LY474937 rDKK-1　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：大腸癌是消化系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一,目前大腸癌已攀升為惡性腫瘤發(fā)病率第3位,且發(fā)病率仍將持續(xù)上升。目前研究提示,腫瘤(包括大腸癌)發(fā)病及進(jìn)展不同階段涉及多基因、多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與。不同信號(hào)通路之間存在相互協(xié)調(diào)、交互作用。在細(xì)胞分化過程中負(fù)責(zé)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)且高度保守的Notch信號(hào)通路發(fā)生異常及通路下游基因變異將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。目前研究表明,Notch信號(hào)通路與大腸癌生物特性密切相關(guān),和包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達(dá),異常增高的Notch-1抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移。且Notch信號(hào)通路在大腸癌發(fā)病中與其他信號(hào)通路存在交互作用。大腸癌細(xì)胞中異常和脫離控制的信號(hào)通路交互作用導(dǎo)致腫瘤形成、并維持干細(xì)胞分化、增殖。在大鼠模型中,敲除Tcf4(WNT信號(hào)失活)情況下,刺激Notch信號(hào)不能引起細(xì)胞增殖,表明細(xì)胞增殖依賴WNT信號(hào),而在Notch信號(hào)抑制情況下,激活WNT通路細(xì)胞向腺瘤性分化。上述結(jié)果表明,Notch和WNT信號(hào)的相互作用在細(xì)胞增殖和腫瘤形成中具有重要作用。因此,本課題首先擬證實(shí)Wnt信號(hào)通路阻斷劑rDKK-1及Notch信號(hào)通路阻斷劑對(duì)大腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞表達(dá)是否存在抑制作用,通過抑制其中一條通路的情況下檢測(cè)另外一條通路表達(dá)變化,以闡明是否存在交互作用。并進(jìn)一步通過分析信號(hào)通路阻斷劑對(duì)細(xì)胞周期、增值、侵襲影響闡明信號(hào)通路阻斷劑作用機(jī)制、臨床應(yīng)用前景。課題第三部分進(jìn)行了移植瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步補(bǔ)充驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。第一部分:信號(hào)通路抑制劑對(duì)Notch信號(hào)及Wnt信號(hào)在HCT-116細(xì)胞中表達(dá)的抑制作用目的:分析信號(hào)通路阻斷劑對(duì)大腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞表達(dá)抑制效果,并通過阻斷其中一條信號(hào)通路后檢測(cè)另外一條信號(hào)通路mRNA、蛋白表達(dá)水平,了解兩條信號(hào)通路之間是否存在交互作用。方法:HCT-116細(xì)胞分為對(duì)照組(DMSO)、Wnt信號(hào)阻斷組(rDKK-1處理)、Notch信號(hào)阻斷組(LY374973處理)藥物處理48小時(shí)后,QRT-PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch1、Notch2、Hes1、DLL4 mRNA的表達(dá)情況及Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因 β-catenin、Pra-1、c-myc mRNA 的表達(dá)情況。采用 Western blotting檢測(cè)信號(hào)通路抑制劑對(duì)上述7個(gè)蛋白表達(dá)抑制程度結(jié)果:阻斷劑 LY374973(40nm,48h)、rDKK-1(50nm,48h)、rDKK-1+ LY374973處理后,LY374973能導(dǎo)致Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Hes1和DLL4表達(dá)下調(diào)(P0.05),對(duì) Notch1、Notch2 表達(dá)無(wú)影響(P0.05)。r-DDK1 能引起 Wnt 通路相關(guān)基因β-catenin、C-myc表達(dá)下調(diào)(P0.05),對(duì)Pra-1表達(dá)無(wú)影響(P0.05)。此外r-DDK1除影響自身通路兩條基因的表達(dá),還能引起Notch信號(hào)通路Hes1和DLL4表達(dá)下調(diào)(P0.05)。Notch通路阻斷劑LY374973對(duì)Wnt通路相關(guān)基因表達(dá)無(wú)影響(P0.05)。共同處理組能引起所檢測(cè)的7條基因表達(dá)下調(diào)。Western blotting結(jié)果支持上述QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果。結(jié)論:信號(hào)通路阻斷劑能降低Notch及Wnt通路相關(guān)基因的表達(dá),阻斷Wnt通路后對(duì)Notch通路表達(dá)存在影響,而阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)Wnt信號(hào)通路表達(dá)無(wú)明顯影響。第二部分:阻斷Notch信號(hào)通路及Wnt信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲、遷移功能,細(xì)胞周期及增殖的影響目的:探討Notch信號(hào)通路阻斷及Wnt信號(hào)阻斷對(duì)大腸癌細(xì)胞系細(xì)胞侵襲、遷移功能,細(xì)胞周期及增殖的影響及其可能的機(jī)制。方法:細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理同第一部分,采用MTT法檢測(cè)抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響,PI染色及流式檢測(cè)細(xì)胞周期變化,Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞侵襲能力,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估藥物處理后細(xì)胞遷徙能力,細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)β-catenin蛋白及Notch1蛋白表達(dá)及位置。結(jié)果:1.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):24小時(shí)以后r-DKK-1處理組(0.836±0.017),LY374973處理組(0.829±0.032),較對(duì)照DMSO組(1.2166±0.022)比較有顯著下降(P0.01),而兩種信號(hào)通路共同阻滯(r-DDK+ LY3 74973)后抑制作用更明顯(0.444±0.055)。觀察至48小時(shí)后,兩種藥物處理細(xì)胞與對(duì)照組相比仍呈抑制狀態(tài)。2.細(xì)胞周期:rDKK-1或LY374973單獨(dú)作用48小時(shí)后,G0/G1期,S期,細(xì)胞的比例沒有明顯的變化(P0.05),而聯(lián)合作用(rDKK-1+LY374973)后G0/G1期細(xì)胞比例則明顯增加(從33.507±2.561%增至61.723±0.766%),P0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S期三種處理因素和對(duì)照組比較均無(wú)差異。而G2/M期三種處理細(xì)胞比例均明顯減少(P0.05)。3.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):DMSO組為(76.667±7.5055)個(gè)/HP,rDKK-1 組為(56.667±5.033)個(gè)/HP,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LY374973 組為(47.667±4.163)個(gè)/HP,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),rDKK-1+LY374973 組為(31.333±2.082)個(gè)/HP,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而rDKK-1和LY374973之間無(wú)明顯差異(P0.05)。3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):rDKK-1組作用24小時(shí)以后,劃痕修復(fù)率為(37.309±4.170%),LY374973組劃痕修復(fù)率為(38.872 ± 0.937%),rDKK-1+LY374973 組劃痕修復(fù)率為(23.455 ±0.73823.455±0.738),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.細(xì)胞免疫熒光:rDkk-1能明顯降低β-catenin蛋白的表達(dá),而LY374973對(duì)其表達(dá)無(wú)影響。LY374973及rDkk-1均未影響Notch1蛋白的表達(dá)。結(jié)論:信號(hào)通路阻滯劑能降低結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力。第三部分:動(dòng)物移植瘤模型目的:裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)結(jié)果及評(píng)估信號(hào)通路阻滯劑對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響方法:建立裸鼠皮下移植瘤模型,成功成瘤后隨機(jī)分組為:①對(duì)照組(注射DMSO);②rDKK-1(5mg/kg,每周給藥一次,一共給藥3次)處理組;③LY374973(4mg/kg,每周給藥一次,一共給藥3次)處理組;④rDKK-1+ LY374973處理組。取出腫瘤組織進(jìn)行,采用第一部分相同QRT-PCR、Western blot檢測(cè)裸鼠移植瘤中第一部分中基因蛋白表達(dá)情況,并于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相對(duì)比。并采用石蠟切片HE染色、石蠟切片免疫組化觀察不同蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果:20只裸鼠19只成瘤,成瘤后開始藥物治療觀察期12天起,LY474937治療組和rDKK-1及共同治療組生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯差別(P0.05)。并隨著治療時(shí)間推移,逐漸明顯。瘤塊檢測(cè)結(jié)果提示:與對(duì)照組相比,Wnt信號(hào)通路阻滯劑rDKK-1未明顯影響Wnt通路3條基因表達(dá)變化,Notch信號(hào)通路阻滯劑LY374973亦未影響Wnt信號(hào)通路基因表達(dá)變化。兩種藥物聯(lián)用時(shí)會(huì)下調(diào)β-catenin、及c-myc表達(dá)。Notch信號(hào)通路阻滯劑LY374973能下調(diào)Notch通路Notch2、Hes1基因表達(dá),對(duì)Notch1、DLL4表達(dá)無(wú)影響。rDKK-1對(duì)Notch通路相關(guān)基因表達(dá)影響同LY374973。兩種藥物聯(lián)合處理組能下調(diào)Notch2、DLL4、Hes1基因表達(dá)。Western blot檢測(cè)支持QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果。結(jié)論:信號(hào)通路阻滯劑對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用,兩種藥物聯(lián)合治療抑制作用更明顯,瘤塊中mRNA及蛋白表達(dá)情況與體外細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)類似但并不完全相同。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34

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1 張燕;鄭志z，

本文編號(hào)：1482178