發(fā)布時(shí)間：2018-02-01 07:23

  本文關(guān)鍵詞： OLC1基因 肺癌 吸煙 基因工程小鼠 mRNA表達(dá)譜　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肺癌是世界范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)。香煙煙霧是約90%肺癌病例的主要危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究利用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization)技術(shù),構(gòu)建了肺癌差異表達(dá)基因文庫(kù)。OLC1 (Overexpressed in lung cancer 1)是從文庫(kù)中篩選、發(fā)現(xiàn)、克隆并命名的一個(gè)基因。進(jìn)一步研究顯示OLC1具有原癌基因?qū)傩�；而且在肺鱗癌發(fā)生的早期(不典型增生和原位癌)階段,其表達(dá)量就已經(jīng)顯著升高。此外,在肺癌組織中OLC1表達(dá)水平在吸煙者中顯著高于非吸煙者。在人肺癌細(xì)胞和人永生化支氣管上皮細(xì)胞中,香煙煙霧凝集物(cigarette smoke condensate, CSC)能夠刺激OLC1表達(dá)上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示,OLCl異常表達(dá)與癌變、吸煙密切相關(guān)。本課題承接研究組前期工作,針對(duì)OLCl基因在吸煙致癌過(guò)程中的作用進(jìn)行研究。首先在較大樣本非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中檢測(cè)OLC1蛋白的表達(dá)情況,并分析其臨床意義。隨后,利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù),以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和基因工程小鼠為研究對(duì)象,分別在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中模擬吸煙因素和OLC1基因異常表達(dá)在吸煙致癌過(guò)程中的作用,以獲得在相關(guān)改變過(guò)程中的基因表達(dá)變化譜型。通過(guò)生物信息學(xué)分析,篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)行相應(yīng)驗(yàn)證,初步探討其在吸煙致癌過(guò)程中的生物學(xué)意義,為揭示OLC1在吸煙致癌過(guò)程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。首先,對(duì)172例NSCLC患者手術(shù)切除組織進(jìn)行OLCl蛋白免疫組織化學(xué)染色以檢測(cè)OLC1在腫瘤組織中的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床信息分析OLC1蛋白水平與性別、吸煙、疾病分期、分化程度等因素之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,OLC1蛋白在癌組織中的水平顯著高于癌旁正常組織,并與肺鱗癌中的吸煙因素顯著相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)主要以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299為研究對(duì)象。Western blot分析結(jié)果顯示,以4-(甲基亞硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)、3-甲基膽葸(MCA)和苯并芘(B[a]P)等香煙中典型致癌物分別處理細(xì)胞,都不影響OLC1蛋白的表達(dá)水平。以香煙煙霧凝集物(CSC)處理后,肺癌細(xì)胞中代謝反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和生物解毒等防御機(jī)制相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平升高。在A549細(xì)胞中,CSC刺激上調(diào)了肺泡間隔發(fā)育和上皮細(xì)胞分化相關(guān)基因；在H1299細(xì)胞中,CSC刺激下調(diào)了細(xì)胞周期功能相關(guān)的基因。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)OLC1的肺癌細(xì)胞系(A549/OLC1, H1299/OLC1) GO富集顯示,OLC1基因改變影響眾多生物學(xué)過(guò)程,如形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞黏附、神經(jīng)元投射引導(dǎo)、循環(huán)系統(tǒng)過(guò)程、細(xì)胞呼吸、轉(zhuǎn)運(yùn)活性調(diào)節(jié)等等。而以CSC刺激穩(wěn)定過(guò)表達(dá)OLC1的A549細(xì)胞,GO富集結(jié)果提示,CSC處理促進(jìn)細(xì)胞黏附相關(guān)mRNA表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步抑制了細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性。利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫、炎癥相關(guān)基因集,在A549細(xì)胞mRNA表達(dá)譜中篩選免疫、炎癥相關(guān)差異表達(dá)基因,再與本實(shí)驗(yàn)室以往構(gòu)建的肺鱗癌多階段發(fā)生模型mRNA表達(dá)譜聯(lián)合分析,最終得到8個(gè)在A549/OLC1細(xì)胞中特異差異表達(dá)的“免疫／炎癥／癌變相關(guān)”基因。采用OLC1全身非特異過(guò)表達(dá)小鼠(C57BL/6J/OLC1)和全身非特異性敲降小鼠(C57BL/6J/OLC1si)進(jìn)行香煙煙霧暴露實(shí)驗(yàn)。分別在香煙暴露3個(gè)月(短期)和7個(gè)月(長(zhǎng)期)后處死小鼠獲取肺組織,進(jìn)行mRNA表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示,OLC1基因在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)以及器官發(fā)育相關(guān)生物學(xué)過(guò)程中有重要作用。此外,C57BL/6J/OLC1小鼠中差異表達(dá)基因的GO富集結(jié)果還顯示OLC1過(guò)表達(dá)與感官知覺(jué)和外界刺激有較大聯(lián)系,而在C57BL/6J/OLC1si小鼠中,差異表達(dá)基因的GO富集體現(xiàn)其與免疫系統(tǒng)相關(guān)。短期香煙暴露刺激都引起小鼠的免疫反應(yīng)相關(guān)mRNA改變。相較于野生型(WT)小鼠,C57BL/6J/OLC1小鼠對(duì)于機(jī)體缺氧反應(yīng)表現(xiàn)更為敏感。而來(lái)源于C57BL/6J/OLC1si小鼠的數(shù)據(jù)提示,吸煙、OLC1基因以及嗅覺(jué)傳導(dǎo)信號(hào)通路三者之間存在聯(lián)系。香煙暴露后,OLC1基因工程小鼠KEGG顯著富集的通路都與黏附功能相關(guān),提示OLC1可能參與細(xì)胞遷移。長(zhǎng)期香煙暴露后,WT小鼠表達(dá)上調(diào)的基因仍然主要富集于機(jī)體對(duì)香煙暴露的防御機(jī)制上,如體液免疫、炎癥反應(yīng)和外界刺激反應(yīng)等；表達(dá)下調(diào)的基因主要與器官發(fā)育有關(guān)。相反,C57BL/6J/OLC1小鼠肺組織中表達(dá)上調(diào)的基因與器官發(fā)育相關(guān),如呼吸系統(tǒng)發(fā)育等。發(fā)育相關(guān)基因mRNA水平重新上調(diào),是癌癥發(fā)生的重要信號(hào)之一。表達(dá)下調(diào)的基因則與蛋白多糖生物合成、蛋白激酶B信號(hào)通路以及細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控等相關(guān),顯示機(jī)體對(duì)香煙暴露刺激的防御機(jī)制受到了抑制。而這些現(xiàn)象都未在C57BL/6J/OLC1si小鼠中出現(xiàn)。與人肺癌細(xì)胞系表達(dá)譜分析方法類似,同樣在小鼠肺組織mRNA表達(dá)譜中篩選得到43個(gè)“免疫／炎癥／癌變相關(guān)”基因。經(jīng)過(guò)KEGG通路顯著富集,最終得到13個(gè)用于候選研究的基因。綜上所述,本項(xiàng)研究顯示OLC1基因在非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織中異常高表達(dá)；CSC處理上調(diào)A549細(xì)胞中肺泡間隔發(fā)育和上皮細(xì)胞分化相關(guān)基因,下調(diào)H1299細(xì)胞中細(xì)胞周期功能相關(guān)的基因；CSC刺激A549/OLC1細(xì)胞后促進(jìn)細(xì)胞黏附相關(guān)基因mRNA上調(diào),進(jìn)一步抑制了細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性；篩選獲得8個(gè)在A549/OLC1細(xì)胞中特異差異表達(dá)的“免疫／炎癥／癌變相關(guān)”基因；OLC1基因工程小鼠mRNA表達(dá)譜結(jié)果揭示OLC1基因在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)以及器官發(fā)育中有重要作用。短期香煙煙霧暴露后,OLC1基因工程小鼠差異基因即顯著富集于黏附相關(guān)通路；長(zhǎng)期香煙暴露后,C57BL/6J/OLC1小鼠肺組織中器官發(fā)育相關(guān)基因上調(diào),機(jī)體針對(duì)香煙煙霧暴露的防御機(jī)制受到抑制；在香煙煙霧暴露的OLCl基因工程小鼠肺組織mRNA表達(dá)譜中篩選獲得13個(gè)“免疫／炎癥／癌變相關(guān)”候選研究基因。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
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本文編號(hào)：1481292