發(fā)布時(shí)間：2018-01-31 15:27

  本文關(guān)鍵詞： EB病毒(EBV) 誘發(fā)淋巴瘤 基因芯片 基因表達(dá)分析 micro-RNAs芯片 分子網(wǎng)絡(luò)　出處：《南華大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的:EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)感染與淋巴瘤的發(fā)生關(guān)系密切,既往多利用體外實(shí)驗(yàn)研究EBV對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用,但無(wú)法全面客觀地反映EBV在體內(nèi)誘發(fā)淋巴瘤的實(shí)際狀況。本研究在構(gòu)建人淋巴細(xì)胞(hu-PBL)/SCID嵌合體小鼠并產(chǎn)生EBV相關(guān)淋巴瘤的基礎(chǔ)上,擬進(jìn)一步鑒定該模型中EBV誘發(fā)瘤的分子病理特性,構(gòu)建誘發(fā)淋巴瘤與相應(yīng)“正常人”淋巴細(xì)胞之間差異基因表達(dá)譜和差異mi RNAs表達(dá)譜,利用生物信息學(xué)分析EBV誘發(fā)淋巴瘤的差異表達(dá)基因和mi RNAs,繪制EBV誘發(fā)淋巴瘤的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),試圖深入揭示EBV誘發(fā)淋巴瘤的分子機(jī)制。方法:從6名健康成人新鮮血液樣本中分離出淋巴細(xì)胞,分別移植于22只SCID小鼠腹腔,每名獻(xiàn)血員的淋巴細(xì)胞分別接種3~4只SCID小鼠,以EBV感染人淋巴細(xì)胞,建立EBV誘發(fā)淋巴瘤模型。應(yīng)用免疫組化法鑒定誘發(fā)瘤的分子病理特征;PCR檢測(cè)誘發(fā)瘤的種屬來(lái)源;應(yīng)用Ig H基因重排檢測(cè)誘發(fā)瘤的克隆性。采用Agilent人類全基因組表達(dá)譜芯片及Exiqon mi RNAs芯片分別檢測(cè)正常人淋巴細(xì)胞與EBV誘發(fā)淋巴瘤的差異表達(dá)基因及差異表達(dá)mi RNAs。運(yùn)用三種差異分子篩選軟件(LIMMA,BRB-Random Variance Model,SAM)同時(shí)篩選再取交集的方法分析差異表達(dá)基因及差異表達(dá)的mi RNAs。采用real-time PCR方法驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用si RNA干擾EBV+淋巴瘤細(xì)胞系中候選關(guān)鍵基因PBK的表達(dá),檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性及體外克隆形成能力。在此基礎(chǔ)上,整合基因芯片和mi RNAs芯片結(jié)果,繪制diffmi RNA-diffgene整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)計(jì)算其富集度,得到在整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵差異表達(dá)基因及差異mi RNAs。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證ebv-mi R-BART16與其預(yù)測(cè)靶基因的靶向關(guān)系。結(jié)果:1.EB病毒誘發(fā)淋巴瘤模型的建立及分子病理特性本實(shí)驗(yàn)在9只存活SCID小鼠體內(nèi)檢出誘發(fā)腫瘤,因來(lái)源于6名獻(xiàn)血員移植的淋巴細(xì)胞,共計(jì)得到6例誘發(fā)瘤組織。誘發(fā)腫瘤位于小鼠胸腔縱隔或腹腔內(nèi),呈不規(guī)則結(jié)節(jié)狀。顯微鏡下觀察誘發(fā)瘤細(xì)胞的體積較大,呈漿母細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞、中心母細(xì)胞和免疫母細(xì)胞樣形態(tài),符合彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的形態(tài)特征。免疫表型檢測(cè)誘發(fā)瘤LCA陽(yáng)性,B細(xì)胞標(biāo)記CD20/CD79a陽(yáng)性,T細(xì)胞標(biāo)記CD3/CD45RO陰性,提示誘發(fā)腫瘤是B細(xì)胞性淋巴瘤。Alu-PCR檢測(cè)誘發(fā)瘤顯示有人特異性Alu序列擴(kuò)增條帶,證實(shí)誘發(fā)瘤屬于人源性,而非鼠源性。EBER原位分子雜交可見(jiàn)瘤細(xì)胞核顯示陽(yáng)性,表明誘發(fā)瘤細(xì)胞內(nèi)存在EB病毒感染。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)誘發(fā)瘤組織中LMP1的表達(dá)升高。Ig H基因重排PCR檢測(cè),顯示該6例誘發(fā)瘤均呈現(xiàn)單克隆的峰和單一電泳條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物。2.EBV誘發(fā)淋巴瘤的基因表達(dá)譜及功能分析采用人類全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)SCID小鼠體內(nèi)的EBV誘發(fā)淋巴瘤組織與相應(yīng)的“正常人”淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜,通過(guò)生物信息學(xué)分析,得到202個(gè)差異表達(dá)基因,其中44個(gè)基因在腫瘤組織中上調(diào),158個(gè)基因下調(diào)。對(duì)基因芯片結(jié)果的GO分析和pathway分析顯示,富集度最高的GOs包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng);富集度最高的pathway為細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和腫瘤免疫逃避。將202個(gè)差異表達(dá)基因的gene Symbol統(tǒng)一映射至HIPPIE的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,計(jì)算這些基因在該分子網(wǎng)絡(luò)中的RS值(Rank Score排序打分),基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析挑選出在分子網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的差異表達(dá)基因,分別是:TOP2A,UHRF1,HIST2H2BE,PHGDH,VCL,IGF1R,FOS,SNAI1,PBK和RNF144B。它們分別涉及細(xì)胞增殖分化、免疫調(diào)節(jié)和免疫逃避等信號(hào)通路。其中TOP2A,UHRF1,PHGDH,PBK基因在誘發(fā)淋巴瘤中表達(dá)上調(diào);HIST2H2BE,VCL,IGF1R,FOS,SNAI1和RNF144B基因在誘發(fā)淋巴瘤中表達(dá)下調(diào)。采用si RNA技術(shù)干擾Daudi淋巴瘤細(xì)胞PBK基因表達(dá),細(xì)胞的生長(zhǎng)速度下降,軟瓊脂克隆形成能力減弱。采用mi RNA芯片檢測(cè)EBV誘發(fā)淋巴瘤與相應(yīng)的“正常人”淋巴細(xì)胞的mi RNA表達(dá)譜,共篩出29個(gè)差異明顯的人類mi RNAs,其中25個(gè)下調(diào),4個(gè)上調(diào);篩出3個(gè)上調(diào)的EB病毒mi RNAs(ebv-mi R-BART16,ebv-mi R-BART8*,ebv-mi R-BART19-3p)。4.差異表達(dá)基因和差異表達(dá)mi RNAs數(shù)據(jù)的整合分析基于上述差異表達(dá)mi RNAs(29 human mi RNAs+3 EBV mi RNAs)與其靶基因的關(guān)系對(duì),結(jié)合差異表達(dá)基因的相互作用PPI網(wǎng)絡(luò),本研究構(gòu)建了EBV誘發(fā)淋巴瘤的diff mi RNAs-diff genes整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)計(jì)算其富集度,得到在整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵mi RNAs為hsa-mi R-23a,hsa-mi R-26a,hsa-mi R-26b,hsa-mi R-32,hsa-mi R-130a和hsa-mi R-222;關(guān)鍵靶基因?yàn)锳URKA,PBK,IL1B和EGF;其中PBK和AURKA在淋巴瘤組織基因芯片檢測(cè)中上調(diào),而IL1B和EGF表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)的EB病毒mi RNAs與宿主細(xì)胞基因的靶向性分析顯示,在基因芯片的差異基因中發(fā)現(xiàn)有能被ebv-mi RNA直接靶向調(diào)控的凋亡相關(guān)基因如RYBP和caspase-6。RYBP又名凋亡相關(guān)蛋白,可通過(guò)與caspase-8,-10等死亡受體凋亡途徑的核心分子相互作用而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。caspase-6為caspase家族成員,是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行分子之一。本研究采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證了ebv-mi R-BART16對(duì)RYBP和caspase-6的靶向作用,結(jié)果證實(shí)RYBP和caspase-6是3.EBV誘發(fā)淋巴瘤的差異mi RNA表達(dá)譜分析ebv-mi R-BART16的靶基因,其表達(dá)受到ebv-mi R-BART16的明顯抑制。結(jié)論:1.通過(guò)構(gòu)建hu-PBL/SCID嵌合體小鼠,成功建立EBV相關(guān)的人源性淋巴瘤動(dòng)物模型,證實(shí)EBV誘發(fā)淋巴瘤來(lái)源于人B淋巴細(xì)胞,呈單克隆性增殖,病理學(xué)診斷類似于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。2.構(gòu)建了EBV誘發(fā)淋巴瘤與其相應(yīng)“正常人”淋巴細(xì)胞差異基因表達(dá)譜,篩選出202個(gè)差異表達(dá)基因,包括44個(gè)上調(diào)基因和158個(gè)下調(diào)基因,主要參與細(xì)胞增殖分化,免疫調(diào)節(jié)和免疫逃避等功能;表明EBV誘發(fā)淋巴瘤是一個(gè)涉及多個(gè)基因、多條通路,且病毒基因與宿主細(xì)胞基因相互作用的復(fù)雜過(guò)程。初步發(fā)現(xiàn)TOP2A,UHRF1,HIST2H2BE,PHGDH,VCL,IGF1R,FOS,SNAI1,PBK和RNF144B等可能是誘發(fā)淋巴瘤的候選關(guān)鍵基因。3.獲得EBV誘發(fā)淋巴瘤的差異mi RNAs表達(dá)譜,篩選出29個(gè)差異明顯的人類mi RNAs和3個(gè)上調(diào)的EB病毒mi RNAs。4.得到EBV誘發(fā)淋巴瘤的差異基因調(diào)控模塊,構(gòu)建了m RNAs-mi RNAs整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果提示EBV可能通過(guò)復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響細(xì)胞周期調(diào)控、介導(dǎo)免疫逃避、促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡信號(hào)等機(jī)制誘導(dǎo)淋巴瘤發(fā)生。5.ebv-mi R-BART16可靶向抑制宿主細(xì)胞RYBP和caspase-6的表達(dá),可能具有抑制細(xì)胞凋亡的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.1;R511

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本文編號(hào)：1479387