發(fā)布時間：2018-01-30 01:18

  本文關(guān)鍵詞： A549 自噬 mTOR FKBP12 溶酶體 細胞周期　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和研究目的目前癌癥是除心臟病和腦血管病變以外的世界三大疾病之一,而在百余種不同病變的痛癥中,至今尚未發(fā)現(xiàn)有特效的治療方法。肺癌因其發(fā)現(xiàn)晚,高致死率在癌癥治療中成為一個全球性難題,而環(huán)境因素尤其是大氣污染和不良生活習(xí)慣如抽煙也加劇了這一病癥的發(fā)展。在所有類型的肺癌中,非小細胞肺癌占據(jù)比重高達85%,大概四分之三的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期,且5年存活率極低。目前除了手術(shù)切除外,化療依舊是治療肺癌必不可少的手段。但化療藥物副作用較大,病人化療過程十分痛苦。因此亟需開發(fā)新的抑制腫瘤生長及發(fā)展的化合物。目前化合物抑制腫瘤生長的作用主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細胞增殖和遷移及誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡等。抑制腫瘤增殖主要是通過阻滯細胞周期來實現(xiàn)的,利用化療藥物抑制細胞內(nèi)DNA復(fù)制,將細胞周期阻滯在G0/G1期,從而阻止細胞分裂,達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。惡性腫瘤難以治愈的一個顯著特點就是其高轉(zhuǎn)移特性,腫瘤細胞實現(xiàn)這一生理過程主要依賴于細胞遷移,因此,抑制腫瘤細胞遷移也是治療腫瘤的有效手段。自噬是哺乳動物中普遍存在的機制,這一保守過程在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用,在多種人類疾病,如神經(jīng)退行性疾病、免疫失調(diào)、心血管疾病、糖尿病尤其是癌癥中都發(fā)現(xiàn)不同程度的自噬失調(diào)。研究表明在多種癌癥發(fā)生中都存在自噬相關(guān)基因不同程度的缺失。細胞凋亡即程序性細胞死亡,誘發(fā)癌細胞凋亡是很多抗癌藥物作用的經(jīng)典方式,而且自噬與凋亡關(guān)系密切,過度的自噬最終會誘導(dǎo)細胞凋亡。因此研究腫瘤細胞的自噬和凋亡的相互關(guān)系和作用,對于尋找腫瘤治療的新靶點,建立腫瘤治療的新策略都具有指導(dǎo)意義。化學(xué)遺傳學(xué)利用具有細胞滲透性的化學(xué)小分子為研究工具,廣泛應(yīng)用在探究細胞信號通路和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持中�；瘜W(xué)小分子因其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單,易于進細胞并且具有作用可逆等優(yōu)點已廣泛應(yīng)用于基因表達水平調(diào)控,信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫研究等領(lǐng)域。研究小分子化合物作用機制能為藥物開發(fā)提供先導(dǎo)化合物,從而縮短抗癌藥物開發(fā)過程,推動腫瘤治療進程。綜上所述,本研究旨在運用化學(xué)遺傳學(xué)手段,篩選能夠有效抑制腫瘤細胞生長的化學(xué)小分子,并進一步探究其抑制腫瘤細胞生長的具體機制,尋找小分子胞內(nèi)作用靶點,以期發(fā)現(xiàn)新的治療腫瘤的分子靶點,建立高效的腫瘤治療機制。研究內(nèi)容1.篩選能夠抑制A549細胞生長的化學(xué)小分子;2.探究化學(xué)小分子在細胞內(nèi)的分布;3.研究化學(xué)小分子在細胞水平及組織水平的作用效果;4.研究化學(xué)小分子抑制A549細胞生長的分子機制;研究方法1.A549及HUVECs細胞的培養(yǎng);2.倒置熒光顯微鏡觀察A549細胞形態(tài)變化;3.SRB法檢測細胞存活率;4.AO染色檢測細胞核斷裂情況;5.LDH法檢測細胞是否壞死;6.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察LC3點狀聚集情況;7.免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3I/II及mTOR的下游底物4EBP1,p70S6K的磷酸化水平變化;8.RNA干擾研究化學(xué)小分子抑制mTOR活性的作用機制;9.免疫熒光法檢測mTOR,LC3與化學(xué)小分子共定位情況;10.激光掃描共聚焦顯微鏡檢測小分子化合物在細胞中的亞定位;11.免疫印跡法檢測化合物對p21和p27的水平影響;12.流式細胞術(shù)分析細胞周期分布;13.雞胚尿囊膜實驗檢測化學(xué)小分子體內(nèi)腫瘤抑制效果。研究結(jié)果1.化學(xué)小分子5a-5i的處理引起A549形態(tài)變得不規(guī)則;2.化學(xué)小分子5a-5i能顯著抑制A549細胞增殖,但對正常細胞HUVECs生長無影響;3.化學(xué)小分子5a-5i短時間處理不引起A549細胞凋亡;4.除化合物5f外,其他化學(xué)小分子不誘導(dǎo)A549細胞壞死;5.化學(xué)小分子5a-5i誘導(dǎo)細胞自噬;6.化合物5e誘導(dǎo)mTOR依賴的完整自噬流;7.化合物5e通過FKBP12抑制mTOR的活性;8.化學(xué)小分子5a-5i具有良好的熒光特性,5e與溶酶體共定位;9.化合物5e抑制體內(nèi)腫瘤生長并且不影響正常血管生成;10.化合物5e誘導(dǎo)實體瘤內(nèi)腫瘤細胞凋亡;11.化學(xué)小分子5a-5i能阻滯A549細胞周期;12.化合物5e抑制A549細胞遷移。結(jié)論1.化學(xué)小分子以濃度和時間依賴的方式抑制A549細胞增殖,其中化合物5e,5g,5h效果較好。2.化合物在短時間內(nèi)誘導(dǎo)細胞自噬而非細胞凋亡,不引起細胞壞死;并且化合物5e誘導(dǎo)完整的自噬流,其誘導(dǎo)的自噬是mTOR依賴的。3.化合物5e通過FKBP12抑制mTOR的活性。4.化學(xué)小分子還能阻滯A549細胞周期,抑制A549細胞遷移。5.該批化學(xué)小分子均具有良好的熒光特性,其中5e熒光最強,且該化合物與溶酶體共定位。
[Abstract]:Cancer is one of the three major diseases in the world except heart disease and cerebrovascular disease . 3 . The cell cycle of A549 cells was inhibited by chemical small molecule 5a - 5and the cell cycle of A549 cells was not affected by chemical small molecule 5a - 5e.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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