九香蟲為蝽科動物九香蟲Aspongopus chinensis Dallas的干燥全蟲,主產(chǎn)于貴州、四川、云南等地,江蘇、安徽、浙江、湖南、湖北、廣東、廣西等地亦產(chǎn)。九香蟲為我國特有種,其藥材價格昂貴,市場上存在著多種混偽品,藥材質(zhì)量差別較大,形態(tài)鑒定是九香蟲常用的鑒定方法,但九香蟲與其混偽品的形態(tài)特征相似,需要具備較強的分類學專業(yè)知識,且主觀性較強。HPLC法可以反映中藥中化學成分的種類和含量高低等,是中藥真?zhèn)舞b定和質(zhì)量控制的有效方法。本研究擬通過其所含的化學成分來探討鑒別九香蟲藥材真?zhèn)蔚目尚行?為九香蟲藥材的真?zhèn)舞b定提供較為客觀的化學鑒定方法。中醫(yī)認為九香蟲具有理氣止痛、溫中助陽功效,現(xiàn)代醫(yī)學臨床研究表明,九香蟲具有較好的抗凝血作用,但其相關的藥理研究較少,有效活性部位以及藥理作用機制尚不明確,活性成分未見報道。本研究期望通過動物體內(nèi)實驗來探究九香蟲抗凝血活性機制,并篩選出有效活性部位,以期為九香蟲的臨床應用和研究提供依據(jù)。目的:鑒別九香蟲真?zhèn)?篩選九香蟲提取物抗凝血活性,探究其抗凝血活性作用機制及有效活性部位。方法:1.收集云南、貴州、四川和廣西等地的25批九香蟲藥材,建立HPLC指紋圖譜,利用化學計量法中的主成分分析和聚類分析方法鑒別九香蟲正品與偽品。2.通過測定部分凝血活酶時間(Activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原時間(Prothrombin time,PT)研究九香蟲水煎提取物、水提醇沉上層溶液、水提醇沉沉淀物和乙醇提取物的抗凝血活性。采用毛細管法測定小鼠的凝血時間(Coagulation time,CT)值,斷尾法測定小鼠尾尖出血時間(Bleeding time,BT)值,來驗證九香蟲在動物體內(nèi)的抗凝血藥效。并通過大鼠體內(nèi)凝血功能實驗,家兔體外血小板聚集實驗,初步探究九香蟲抗凝血作用機制。3.對九香蟲提取物進行分離純化,經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱色譜分離,得到不同乙醇濃度的洗脫部位,并分別測定其抗凝血活性,找出有效活性部位。純化活性部位,篩選出抗凝血活性單體。結果:1.九香蟲藥材鑒別:25批九香蟲藥材商品,性狀鑒定為正品8批,偽品14批(包括小皺蝽、麻皮蝽、無刺蝽、黑兜蟲、荔蝽等品種),摻偽品3批。通過HPLC法對25批藥材商品進行分析,其中麻皮蝽與九香蟲正品無共有峰,九香蟲若蟲與九香蟲正品只有3、4號峰為共有峰,但含量差別較大,圖譜形狀不一,HPLC法可以直接將麻皮蝽和若蟲鑒定出來。其余22批藥材建立HPLC指紋圖譜,生成對照圖譜R,含有6個共有峰。不同批次之間HPLC圖譜與對照圖譜R的相似度在0.643-0.964之間,正品和混偽品之間化學成分含量差異較大。運用主成分分析法對22批樣品共有峰的峰面積進行統(tǒng)計分析,其中第1、第2和第3主成分的累積貢獻率達到91.55%,具有較高的代表性,其結果顯示小皺蝽與九香蟲正品區(qū)別較大。在主成分分析的基礎上,以降維后的三個主成分為變量,系統(tǒng)聚類方法采用組之間的鏈接法與平方歐式距離法,結果顯示九香蟲正品聚為一類、小皺蝽聚為一類、其余樣品分為兩類,只有一批摻偽品歸為九香蟲正品中,可能原因是摻偽品中九香蟲占比較多,化學成分主要以正品體現(xiàn)居多。聚類分析方法與主成分分析方法結果基本一致。2.九香蟲抗凝血活性藥效研究:水煎液提取物和水提醇沉上層溶液具有明顯的抗凝血作用,抗凝血有效物質(zhì)應集中在水提醇沉上層溶液中。九香蟲水提醇沉上層溶液能夠明顯延長小鼠的凝血時間CT值及尾尖出血時間BT值,說明九香蟲水提醇沉提取物在動物體內(nèi)具有明顯的抗凝血活性。通過大鼠凝血功能試驗,證明九香蟲體內(nèi)抗凝血過程是通過APTT途徑,針對內(nèi)源性凝血途徑中存在的凝血因子發(fā)揮作用的;通過家兔體外血小板聚集實驗說明,九香蟲水提醇沉提取物能夠影響血小板的正常生理功能,對于血小板的聚集有著顯著的抑制效果。3.九香蟲抗凝血活性部位以及活性成分的篩選:九香蟲水提醇沉物經(jīng)D101大孔吸附樹脂分離后,50%、70%和90%乙醇洗脫部位活性最強,為抗凝血活性部位。以上活性部位經(jīng)分離純化,得到四個單體化合物,結構鑒定出一個化合物為aspongester A。結論:HPLC指紋圖譜結合化學計量學方法,能夠較為客觀準確鑒別九香蟲真?zhèn)�。水提醇沉法為抗凝血活性部位最佳提取方法。其水提醇沉提取物在大鼠體內(nèi)通過內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮抗凝血功效,并且能夠抑制血小板聚集。另外,九香蟲水提醇沉提取物有效活性部位集中在高濃度乙醇洗脫部位,并且從中分離純化得到一個酯類化合物aspongester A。綜合以上實驗結果可知,九香蟲抗凝血活性成分是可以用水煎提取的多種成分,沸水煎煮提取可以去除脂肪酸等大量雜質(zhì),但能同時保留醇溶性的活性成分,繼而可通過水提醇沉法進一步精制;同時說明抗凝血活性可能是多種成分共同作用的結果,不是單一化學成分發(fā)揮藥效的。本研究為九香蟲藥材的真?zhèn)舞b定提供了較為客觀的化學鑒定方法,動物體內(nèi)實驗驗證了九香蟲提取物抗凝血活性,并探究了其抗凝血活性作用機制及有效活性部位,為九香蟲的進一步開發(fā)利用研究提供了一定的依據(jù)。
【學位單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R284.1;R285
【部分圖文】：

湖北中醫(yī)藥大學 2019 屆碩士學位論文剩余 22 批藥材商品建立九香蟲藥材指紋圖譜見圖 1-1，以 S1 作為參比圖譜，采用中位數(shù)法，在時間窗寬度為 10 時，標記共有峰 6 個，生成對照圖譜 R 見圖 1-2。不同品種的九香蟲商品 6 個共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)見表 1-8，共有峰的相對保留時間見表 1-9 。S23、S24 號麻皮蝽與對照圖譜 R 的對比圖見圖 1-3，S25 九香蟲若蟲與對照圖譜 R 的對比圖見圖1-4。

麻皮蝽(S24、S23)與對照圖譜R對比圖

圖 1-5 22 批樣品主成分得分圖由表 1-12 可知，6 個共有峰中，5 號峰和 6 號峰對主成分因子 1 的貢獻較大，2 號峰、3 號和 4 號峰對主成分 2 貢獻最大，1 號峰和 2 號峰對主成分 3 貢獻大。22 批九香蟲藥材商品中，把外觀鑒別為相同種的藥材商品備注為一個編號：S1、S2、S3、S4、S9、S16、S18 和 S21 鑒定為九香蟲正品標記為1，S5、S6、S7、S11、S13、S15、S17 和 S20 鑒定為小皺蝽標記為 2，S8 鑒定為荔蝽標記為 3，S12 鑒定為黑兜蟲和無刺蝽的混雜品標記為 4，S22 鑒定為無刺蝽標記為 5，幾個正品與偽品的混雜品分別標記為 6 和 7，具體信息見表 1-1。由主成分得分圖 1-5 可知：標記為 1 的樣品和 2 的樣品分別較為集中，
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本文編號：2894084