發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 04:00

　　 九香蟲為蝽科動物九香蟲Aspongopus chinensis Dallas的干燥全蟲,主產(chǎn)于貴州、四川、云南等地,江蘇、安徽、浙江、湖南、湖北、廣東、廣西等地亦產(chǎn)。九香蟲為我國特有種,其藥材價(jià)格昂貴,市場上存在著多種混偽品,藥材質(zhì)量差別較大,形態(tài)鑒定是九香蟲常用的鑒定方法,但九香蟲與其混偽品的形態(tài)特征相似,需要具備較強(qiáng)的分類學(xué)專業(yè)知識,且主觀性較強(qiáng)。HPLC法可以反映中藥中化學(xué)成分的種類和含量高低等,是中藥真?zhèn)舞b定和質(zhì)量控制的有效方法。本研究擬通過其所含的化學(xué)成分來探討鑒別九香蟲藥材真?zhèn)蔚目尚行?為九香蟲藥材的真?zhèn)舞b定提供較為客觀的化學(xué)鑒定方法。中醫(yī)認(rèn)為九香蟲具有理氣止痛、溫中助陽功效,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床研究表明,九香蟲具有較好的抗凝血作用,但其相關(guān)的藥理研究較少,有效活性部位以及藥理作用機(jī)制尚不明確,活性成分未見報(bào)道。本研究期望通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來探究九香蟲抗凝血活性機(jī)制,并篩選出有效活性部位,以期為九香蟲的臨床應(yīng)用和研究提供依據(jù)。目的:鑒別九香蟲真?zhèn)?篩選九香蟲提取物抗凝血活性,探究其抗凝血活性作用機(jī)制及有效活性部位。方法:1.收集云南、貴州、四川和廣西等地的25批九香蟲藥材,建立HPLC指紋圖譜,利用化學(xué)計(jì)量法中的主成分分析和聚類分析方法鑒別九香蟲正品與偽品。2.通過測定部分凝血活酶時(shí)間(Activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time,PT)研究九香蟲水煎提取物、水提醇沉上層溶液、水提醇沉沉淀物和乙醇提取物的抗凝血活性。采用毛細(xì)管法測定小鼠的凝血時(shí)間(Coagulation time,CT)值,斷尾法測定小鼠尾尖出血時(shí)間(Bleeding time,BT)值,來驗(yàn)證九香蟲在動物體內(nèi)的抗凝血藥效。并通過大鼠體內(nèi)凝血功能實(shí)驗(yàn),家兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn),初步探究九香蟲抗凝血作用機(jī)制。3.對九香蟲提取物進(jìn)行分離純化,經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱色譜分離,得到不同乙醇濃度的洗脫部位,并分別測定其抗凝血活性,找出有效活性部位。純化活性部位,篩選出抗凝血活性單體。結(jié)果:1.九香蟲藥材鑒別:25批九香蟲藥材商品,性狀鑒定為正品8批,偽品14批(包括小皺蝽、麻皮蝽、無刺蝽、黑兜蟲、荔蝽等品種),摻偽品3批。通過HPLC法對25批藥材商品進(jìn)行分析,其中麻皮蝽與九香蟲正品無共有峰,九香蟲若蟲與九香蟲正品只有3、4號峰為共有峰,但含量差別較大,圖譜形狀不一,HPLC法可以直接將麻皮蝽和若蟲鑒定出來。其余22批藥材建立HPLC指紋圖譜,生成對照圖譜R,含有6個共有峰。不同批次之間HPLC圖譜與對照圖譜R的相似度在0.643-0.964之間,正品和混偽品之間化學(xué)成分含量差異較大。運(yùn)用主成分分析法對22批樣品共有峰的峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,其中第1、第2和第3主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到91.55%,具有較高的代表性,其結(jié)果顯示小皺蝽與九香蟲正品區(qū)別較大。在主成分分析的基礎(chǔ)上,以降維后的三個主成分為變量,系統(tǒng)聚類方法采用組之間的鏈接法與平方歐式距離法,結(jié)果顯示九香蟲正品聚為一類、小皺蝽聚為一類、其余樣品分為兩類,只有一批摻偽品歸為九香蟲正品中,可能原因是摻偽品中九香蟲占比較多,化學(xué)成分主要以正品體現(xiàn)居多。聚類分析方法與主成分分析方法結(jié)果基本一致。2.九香蟲抗凝血活性藥效研究:水煎液提取物和水提醇沉上層溶液具有明顯的抗凝血作用,抗凝血有效物質(zhì)應(yīng)集中在水提醇沉上層溶液中。九香蟲水提醇沉上層溶液能夠明顯延長小鼠的凝血時(shí)間CT值及尾尖出血時(shí)間BT值,說明九香蟲水提醇沉提取物在動物體內(nèi)具有明顯的抗凝血活性。通過大鼠凝血功能試驗(yàn),證明九香蟲體內(nèi)抗凝血過程是通過APTT途徑,針對內(nèi)源性凝血途徑中存在的凝血因子發(fā)揮作用的;通過家兔體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)說明,九香蟲水提醇沉提取物能夠影響血小板的正常生理功能,對于血小板的聚集有著顯著的抑制效果。3.九香蟲抗凝血活性部位以及活性成分的篩選:九香蟲水提醇沉物經(jīng)D101大孔吸附樹脂分離后,50%、70%和90%乙醇洗脫部位活性最強(qiáng),為抗凝血活性部位。以上活性部位經(jīng)分離純化,得到四個單體化合物,結(jié)構(gòu)鑒定出一個化合物為aspongester A。結(jié)論:HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,能夠較為客觀準(zhǔn)確鑒別九香蟲真?zhèn)�。水提醇沉法為抗凝血活性部位最佳提取方法。其水提醇沉提取物在大鼠體內(nèi)通過內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮抗凝血功效,并且能夠抑制血小板聚集。另外,九香蟲水提醇沉提取物有效活性部位集中在高濃度乙醇洗脫部位,并且從中分離純化得到一個酯類化合物aspongester A。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,九香蟲抗凝血活性成分是可以用水煎提取的多種成分,沸水煎煮提取可以去除脂肪酸等大量雜質(zhì),但能同時(shí)保留醇溶性的活性成分,繼而可通過水提醇沉法進(jìn)一步精制;同時(shí)說明抗凝血活性可能是多種成分共同作用的結(jié)果,不是單一化學(xué)成分發(fā)揮藥效的。本研究為九香蟲藥材的真?zhèn)舞b定提供了較為客觀的化學(xué)鑒定方法,動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了九香蟲提取物抗凝血活性,并探究了其抗凝血活性作用機(jī)制及有效活性部位,為九香蟲的進(jìn)一步開發(fā)利用研究提供了一定的依據(jù)。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284.1;R285
【部分圖文】：

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文剩余 22 批藥材商品建立九香蟲藥材指紋圖譜見圖 1-1，以 S1 作為參比圖譜，采用中位數(shù)法，在時(shí)間窗寬度為 10 時(shí)，標(biāo)記共有峰 6 個，生成對照圖譜 R 見圖 1-2。不同品種的九香蟲商品 6 個共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)見表 1-8，共有峰的相對保留時(shí)間見表 1-9 。S23、S24 號麻皮蝽與對照圖譜 R 的對比圖見圖 1-3，S25 九香蟲若蟲與對照圖譜 R 的對比圖見圖1-4。

麻皮蝽(S24、S23)與對照圖譜R對比圖

圖 1-5 22 批樣品主成分得分圖由表 1-12 可知，6 個共有峰中，5 號峰和 6 號峰對主成分因子 1 的貢獻(xiàn)較大，2 號峰、3 號和 4 號峰對主成分 2 貢獻(xiàn)最大，1 號峰和 2 號峰對主成分 3 貢獻(xiàn)大。22 批九香蟲藥材商品中，把外觀鑒別為相同種的藥材商品備注為一個編號：S1、S2、S3、S4、S9、S16、S18 和 S21 鑒定為九香蟲正品標(biāo)記為1，S5、S6、S7、S11、S13、S15、S17 和 S20 鑒定為小皺蝽標(biāo)記為 2，S8 鑒定為荔蝽標(biāo)記為 3，S12 鑒定為黑兜蟲和無刺蝽的混雜品標(biāo)記為 4，S22 鑒定為無刺蝽標(biāo)記為 5，幾個正品與偽品的混雜品分別標(biāo)記為 6 和 7，具體信息見表 1-1。由主成分得分圖 1-5 可知：標(biāo)記為 1 的樣品和 2 的樣品分別較為集中，
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本文編號：2894084