發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 06:56

　　 目的觀察慢性心力衰竭對(duì)腎功能和腎臟纖維化的影響及益氣溫陽(yáng)活血利水法的干預(yù)作用,探討"水火相濟(jì)"理論內(nèi)涵。方法隨機(jī)將50只C57BL/6J小鼠分為假手術(shù)組、模型組、中藥低、中、高劑量組,通過(guò)主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立慢性心力衰竭模型小鼠,造模后中藥低、中、高劑量組給予益氣溫陽(yáng)活血利水中藥對(duì)應(yīng)劑量灌胃,假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃,連續(xù)給藥8周后,小動(dòng)物超聲檢測(cè)小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)、收縮分?jǐn)?shù)變化。于末次給藥2 h后取材,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐、尿素氮水平,微量酶標(biāo)法檢測(cè)血清GSH含量,冰凍切片檢測(cè)腎臟組織ROS水平,免疫組化法檢測(cè)腎臟CollagenⅠ、CollagenⅢ、p53、COX2、FTH1、GPX4蛋白表達(dá)情況,RT-PCR法檢測(cè)腎臟組織P53、SLC7A11、GPX4、PTGS2、NOX1、FTH1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較,模型組小鼠心臟EF、FS、GSH水平顯著降低,SCr、BUN、ROS水平顯著升高,腎臟CollagenⅠ、CollagenⅢ、JNK、p53、PTGS2、NOX1蛋白或mRNA水平顯著升高,GPX4、FTH1、SLC7A11蛋白或mRNA水平顯著降低;與模型組比較,經(jīng)治療后各項(xiàng)指標(biāo)水平明顯改善,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論益氣溫陽(yáng)活血利水法在改善CHF小鼠心功能的同時(shí)能夠改善腎臟損傷,減少纖維化,其機(jī)制可能與抑制JNK/p53信號(hào)通路表達(dá),進(jìn)一步調(diào)控SLC7A11/GPX4/GSH和PTGS2/NOX1信號(hào)通路進(jìn)而降低ROS水平減少細(xì)胞鐵死亡。
【部分圖文】：

小鼠腎臟蛋白表達(dá)水平

鐵是機(jī)體內(nèi)重要的微量元素之一,在細(xì)胞增殖、分化能量代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用,體內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)對(duì)機(jī)體具有重要作用,細(xì)胞鐵死亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞非程序性死亡的一種方式,是由于鐵離子過(guò)度沉積等導(dǎo)致ROS水平升高,激活氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡,同時(shí)NADPH依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化和谷胱甘肽(glutathione, GSH)耗損在鐵死亡中也具有重要作用,GSH水平降低導(dǎo)致GPX4失活,通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中ROS生成的積累而引起鐵死亡[15-16]。在鐵死亡發(fā)生的過(guò)程中p53,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain 1,FTH1),NADPH氧化酶1(NADPH oxidase 1,NOX1)等發(fā)揮了重要作用,已有研究表明在某些腫瘤細(xì)胞中,p53激活是鐵死亡發(fā)生的額必要條件,p53能夠抑制下游基因SLC7A11表達(dá),SLC7A11表達(dá)被抑制后導(dǎo)致GSH水平減低或消耗,導(dǎo)致GPX4失活[17]。與此同時(shí)p53能夠激活PTGS2表達(dá)導(dǎo)致NOX1介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高,增加ROS反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[18]。過(guò)度的鐵離子主要儲(chǔ)存于鐵蛋白中,已有研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡時(shí)FTH1水平明顯降低[19]。JNK是哺MAPK信號(hào)通路中的重要蛋白,已有研究表明JNK在心力衰竭中表達(dá)明顯升高,且其可以調(diào)控p53表達(dá),因此本研究提出了慢性心力衰竭是否通過(guò)JNK/p53信號(hào)通路表達(dá)引起腎臟功能損傷,且益氣溫陽(yáng)活血利水法改善心功能的同時(shí)是否能夠通過(guò)調(diào)控JNK/p53信號(hào)通路改善腎臟損傷。研究結(jié)果顯示,CHF小鼠SCr、BUN水平顯著升高,表明本研究所使用的慢性心力衰竭小鼠伴隨著腎功能改變,免疫組化檢測(cè)小鼠腎臟Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎臟Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯升高,表明已經(jīng)有腎臟纖維化發(fā)生,經(jīng)過(guò)中藥治療后,CHF小鼠心臟EF、FS水平明顯升高,SCr、BUN水平明顯降低,Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯降低,表明益氣溫陽(yáng)活血利水中藥在改善心功能的同時(shí)能夠改善腎功能,抑制腎臟纖維化。腎臟組織ROS水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎臟ROS水平顯著升高,且經(jīng)中藥治療后ROS水平明顯降低,血清GSH結(jié)果檢測(cè)顯示,模型組小鼠血清GSH水平顯著降低,經(jīng)治療后明顯改善。免疫組化及RT-PCR結(jié)果顯示,模型組小鼠腎臟JNK、p53、PTGS2、NOX1蛋白或mRNA水平顯著升高,GPX4、FTH1、SLC7A11蛋白或mRNA水平顯著降低。研究表明,益氣溫陽(yáng)活血利水法在改善CHF小鼠心功能的同時(shí)能夠改善腎臟損傷,減少纖維化,其機(jī)制可能與抑制JNK/p53信號(hào)通路表達(dá),進(jìn)一步調(diào)控SLC7A11/GPX4/GSH和PTGS2/NOX1信號(hào)通路進(jìn)而降低ROS水平改善細(xì)胞鐵死亡。課題組亦進(jìn)一步采用多種動(dòng)物模型和細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證,深入闡明慢性心力衰竭對(duì)腎功能的影響以及“水火相濟(jì)”理論內(nèi)涵。

研究結(jié)果顯示,CHF小鼠SCr、BUN水平顯著升高,表明本研究所使用的慢性心力衰竭小鼠伴隨著腎功能改變,免疫組化檢測(cè)小鼠腎臟Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎臟Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯升高,表明已經(jīng)有腎臟纖維化發(fā)生,經(jīng)過(guò)中藥治療后,CHF小鼠心臟EF、FS水平明顯升高,SCr、BUN水平明顯降低,Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯降低,表明益氣溫陽(yáng)活血利水中藥在改善心功能的同時(shí)能夠改善腎功能,抑制腎臟纖維化。腎臟組織ROS水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎臟ROS水平顯著升高,且經(jīng)中藥治療后ROS水平明顯降低,血清GSH結(jié)果檢測(cè)顯示,模型組小鼠血清GSH水平顯著降低,經(jīng)治療后明顯改善。免疫組化及RT-PCR結(jié)果顯示,模型組小鼠腎臟JNK、p53、PTGS2、NOX1蛋白或mRNA水平顯著升高,GPX4、FTH1、SLC7A11蛋白或mRNA水平顯著降低。研究表明,益氣溫陽(yáng)活血利水法在改善CHF小鼠心功能的同時(shí)能夠改善腎臟損傷,減少纖維化,其機(jī)制可能與抑制JNK/p53信號(hào)通路表達(dá),進(jìn)一步調(diào)控SLC7A11/GPX4/GSH和PTGS2/NOX1信號(hào)通路進(jìn)而降低ROS水平改善細(xì)胞鐵死亡。課題組亦進(jìn)一步采用多種動(dòng)物模型和細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證,深入闡明慢性心力衰竭對(duì)腎功能的影響以及“水火相濟(jì)”理論內(nèi)涵。圖2 小鼠腎臟蛋白表達(dá)水平
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