發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 05:08

　　 目的:研究積雪草酸(AA)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響;利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)觀察AA對(duì)人肝癌裸鼠移植腫瘤生長(zhǎng)的影響,從而研究AA體內(nèi)抗肝癌效應(yīng)及其凋亡的機(jī)制方法:不同濃度的AA作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h后顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)變化,CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力值,AnnexinV-APC/7-AAD雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率變化,JC-1試劑盒檢測(cè)肝癌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位改變,蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。熒光素酶逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞,嘌呤霉素梯度篩選得到穩(wěn)定感染的克隆肝癌細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)SMMC-7721-Luc)。選用4~5周齡雄性BALB/c裸鼠15只,建立人肝癌SMMC-7721-Luc細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型后,隨機(jī)分為模型組、AA 50mg/Kg組和AA 100mg/Kg組,每組5只。各組裸鼠連續(xù)灌胃給藥21 d,分別于給藥第7 d,14 d,21 d進(jìn)行活體成像觀察,并在末次活體成像觀察后處死裸鼠后取瘤塊稱(chēng)重并測(cè)量其體積大小,HE病理染色觀察瘤塊內(nèi)細(xì)胞形態(tài)以及數(shù)量的變化;TUNEL染色法檢測(cè)瘤塊細(xì)胞凋亡情況;免疫組織化學(xué)法測(cè)定瘤塊P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)的平均積分光密度值(IOD);Western Blot法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在腫瘤組織中的表達(dá)。結(jié)果:CCK-8結(jié)果顯示:與溶劑對(duì)照組相比,隨著AA濃度的增加,抑制率增大,細(xì)胞數(shù)量變少,形態(tài)變圓,呈濃度依賴(lài)性(P0.01),IC_(50)=38.31μM;AnnexinV-APC/7-AAD雙染色法流式結(jié)果顯示:與溶劑對(duì)照組相比,隨著濃度的增加,AA顯著提高對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率(P0.01);此外,JC-1結(jié)果顯示:與溶劑對(duì)照組比較,AA濃度依賴(lài)性降低線(xiàn)粒體膜電位(P0.01),在熒光顯微鏡下可以看到紅色/綠色熒光的比值隨濃度的增大而明顯降低;Western blot結(jié)果顯示:40μM AA明顯上調(diào)Bax,Cyt-C和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)(P0.05或P0.01),下調(diào)Bcl-2,Caspase-3的表達(dá)(P0.01),但不影響P53的表達(dá)(P0.05)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,成功構(gòu)建了人肝癌SMMC-7721-Luc裸鼠皮下移植瘤模型�；铙w成像動(dòng)態(tài)觀察顯示,與模型組相比較,50mg/Kg組和100mg/Kg組的AA能明顯抑制腫瘤的增長(zhǎng)(P0.01);瘤塊稱(chēng)重和體積測(cè)量結(jié)果顯示:與模型組比較,100mg/Kg的AA能明顯減少瘤塊的質(zhì)量和體積(P0.01)。HE病理染色結(jié)果顯示,與模型組相比,AA 50mg/Kg和AA 100mg/Kg劑量組均能不同程度地促進(jìn)肝腫瘤組織細(xì)胞凋亡:細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài),細(xì)胞數(shù)減少;TUNEL染色結(jié)果顯示:與模型組比較,50mg/Kg AA組和100mg/Kg AA組均能使肝腫瘤細(xì)胞凋亡率逐漸增高(P0.01);免疫組織化學(xué)方法結(jié)果顯示:與模型組比較,Bax,Cyt-C,Caspase-3在AA 50mg/Kg劑量組和AA 100mg/Kg劑量組中平均積分光密度值陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域均明顯升高,Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),P53表達(dá)無(wú)明顯變化,無(wú)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Western Blot結(jié)果顯示,與模型組相比,Bax,Cyt-C,Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)在50mg/Kg和100mg/Kg AA組中均明顯升高,Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P0.05或P0.01),P53蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異(P0.05)。結(jié)論:AA可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞體外增殖及裸鼠移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng),其機(jī)制可能與AA誘導(dǎo)非P53依賴(lài)的線(xiàn)粒體途徑的凋亡有關(guān)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285
【部分圖文】：

圖 1：積雪草酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 The chemical structure ofAsiaticAcid現(xiàn)，AA 在癌癥腫瘤的防治領(lǐng)域具有良聯(lián)合使用能保護(hù)肝臟，降低毒副作用[11]素瘤[12]；通過(guò)激活人乳腺癌細(xì)胞外信號(hào)激酶的通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期[13]；AA 還通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作與人肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程[14]。用于在對(duì)抗癌癥方面和開(kāi)發(fā)各種腫瘤的得了一定的初步進(jìn)展，但是 AA 用于國(guó)人口基數(shù)大，是世界上肝癌的患病大 據(jù)研究報(bào)道可以用于保護(hù)肝臟，保護(hù)腦

1 不同濃度 AA 作用 24 h 對(duì)人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞形態(tài)的影響（orphological changes of human hepatoma SMMC-7721 cells affected24 h (×200)圖 1-1-2 AA 對(duì)人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞增殖的影響（n=3） Effect ofAAon the proliferation of human hepatoma SMMC-7721 ceV-APC/7-AAD 雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) A細(xì)胞的凋亡影響

19圖 1-1-2 AA 對(duì)人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞增殖的影響（n=3）ect ofAAon the proliferation of human hepatoma SMMC-77APC/7-AAD 雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞的凋亡影響APC/7-AAD 雙染色法流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)（3.06±0.08）%，與溶劑對(duì)照組比較，隨著 A癌 SMMC-7721 細(xì)胞產(chǎn)生明顯的凋亡，并且
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