發(fā)布時間：2020-07-07 11:37

【摘要】：背景阿霉素(Doxorubicin,DOX)用于臨床上常見惡性腫瘤的治療,作用廣譜,效果顯著,然而其心肌毒性作用,使患者的生活質(zhì)量下降,限制了在臨床上的使用。其引發(fā)心肌毒性的信號通路較多,包括細(xì)胞自噬和凋亡。刺梨果實中含有豐富的黃酮,平均含量6.8g/kg,最高達(dá)8g/kg。研究發(fā)現(xiàn),這種果實中的黃酮成分具有抗氧化、保護(hù)心臟血管的作用,但對于阿霉素引起的心肌毒性是否具有保護(hù)作用知之甚少。本研究通過培養(yǎng)心肌細(xì)胞,探討刺梨黃酮對阿霉素引起心肌毒性時自噬及凋亡的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。目的探討刺梨黃酮(Flavonoids of Rosa roxburghii Tratt,FRRT)對阿霉素(DOX)引起心肌細(xì)胞自噬和凋亡的影響及其機(jī)制。方法采用原代分離培養(yǎng)出生1-3d的新生大鼠心肌細(xì)胞和H9C2心肌細(xì)胞株,應(yīng)用濃度為5μmol/L的阿霉素孵育心肌細(xì)胞,建成心肌細(xì)胞毒性模型組,并用刺梨黃酮提前進(jìn)行干預(yù),通過透射電子顯微鏡察看各組H9C2心肌細(xì)胞株超微結(jié)構(gòu)。使用免疫熒光和Western Blotting技術(shù)檢測自噬有關(guān)基因(LC3-II、P62)、凋亡有關(guān)基因(Bax、P53和Bcl-2)的具體分布和表達(dá),并應(yīng)用Image J及Grapf Pad Prism 5軟件對Western Blotting檢測的結(jié)果,進(jìn)行半定量分析。結(jié)果1.形態(tài)學(xué)觀察1.1 DOX組細(xì)胞生長狀態(tài)不良,大多細(xì)胞縮小且呈現(xiàn)高折光的圓形。Control組細(xì)胞生長狀態(tài)良好,細(xì)胞形態(tài)大多呈現(xiàn)長梭形,心肌細(xì)胞規(guī)律搏動。FRRT組,只可見部分細(xì)胞縮小呈高折光的圓形狀態(tài),大多數(shù)仍是長梭形。1.2透射電鏡觀察顯示DOX組細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大量的自噬泡和脂褐素,各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊不清,細(xì)胞狀態(tài)差;FRRT干預(yù)后,心肌細(xì)胞未見脂褐素的結(jié)構(gòu),只有少量自噬泡的出現(xiàn),各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰可見。2.免疫熒光檢測2.1自噬相關(guān)蛋白檢測顯示,LC3-II在DOX組中大量表達(dá)在細(xì)胞核周圍,Control組中LC3-II表達(dá)不明顯,FRRT組中散在表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中;P62在DOX組中只有極個別細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),Control組中在大多數(shù)心肌細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)明顯,FRRT組中部分細(xì)胞表達(dá)P62。陰性對照組未見LC3-II、P62的陽性表達(dá)。2.2凋亡相關(guān)蛋白檢測顯示,Bax在DOX組細(xì)胞質(zhì)中均勻表達(dá),Control組及FRRT組中未檢測到明顯表達(dá);P53在DOX組細(xì)胞核中呈點狀大量表達(dá),Control組中表達(dá)不明顯,FRRT組中呈點狀少量表達(dá);Bcl-2在DOX組細(xì)胞核周圍胞質(zhì)中少量表達(dá);Control組和FRRT組在細(xì)胞核周圍胞質(zhì)中表達(dá)明顯。陰性對照組未見Bax、P53、Bcl-2的陽性表達(dá)。3.Western Blotting檢測3.1自噬相關(guān)蛋白檢測顯示,LC3-II在DOX組中表達(dá)較Control組、FRRT組顯著增加,組間比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(**P0.01),FRRT組與Control組相比略增加,組間比較,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);P62在DOX組中表達(dá)較Control組、FRRT組減少,組間比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(**P0.01),FRRT與Control組相比表達(dá)稍減少,組間比較,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.2凋亡相關(guān)蛋白檢測顯示,Bax在DOX組中表達(dá)較Control組、FRRT組增加,組間比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P0.05),FRRT組較Control組表達(dá)稍增加,組間比較,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);P53在DOX組中表達(dá)較Control組、FRRT組增加,FRRT組與Control組相比表達(dá)增加不明顯,各組間相比,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Bcl-2在DOX組中表達(dá)較Control組、FRRT組減少,組間比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(**P0.01),FRRT組與Control組比較表達(dá)減少,組間比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P0.05)。結(jié)論刺梨黃酮通過下調(diào)阿霉素引起的心肌細(xì)胞自噬和心肌細(xì)胞凋亡作用,進(jìn)而在阿霉素誘導(dǎo)心肌毒性中發(fā)揮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

免疫熒光檢測不同時間原代心肌細(xì)胞中LC3-II的表達(dá)Fig.1TheexpressionofLC3-IIinprimarymyocardialcellswithimmunofluorescenceatdifferenttimes

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文H9C2 心肌細(xì)胞用 5μmol/L 阿霉素孵育，提取不同孵育時間（1h、3h、6h、12h、18h、24h）的蛋白。進(jìn)行 WB 檢測，結(jié)果顯示為阿霉素孵育細(xì)胞 12h 時，自噬相關(guān)基因 LC3-II 表達(dá)最多，12 小時前 3 個時間組 LC3-II 幾乎沒有表達(dá)，后 2 組較 12 h表達(dá)下降。12 h 組與其余 5 組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（**P<0.01）（圖 2）。

Western Blotting 檢測不同濃度和時間 H9C2 心肌細(xì)胞中 LC3-II 的表達(dá)（注：組間比較：*P<0.05）ig3 The expression of LC3-II in H9C2 myocardial cells with Western Blotting at differentConcentrations and times. Note：Comparison between groups：*P<0.05）組原代分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞形態(tài)梯度濃度篩選顯示，80μg/mL 刺梨黃酮干預(yù)后，對心肌細(xì)胞影響明顯，顯微鏡察，阿霉素組細(xì)胞生長狀態(tài)不良，大多細(xì)胞縮小且呈現(xiàn)高折光的圓形。空白對細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)多呈現(xiàn)長梭形，心肌細(xì)胞規(guī)律搏動。刺梨黃酮組，見部細(xì)胞縮小呈高折光的圓形狀態(tài)，大多數(shù)仍是長梭形狀態(tài)（圖 4）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2745073