發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 18:38

【摘要】：目的建立D-半乳糖致神經(jīng)干細(xì)胞體外老化模型,人參皂苷干預(yù)老化神經(jīng)干細(xì)胞以后,量化神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)維持生物學(xué)特性的兩個(gè)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子SOX2和BMI-1的表達(dá)變化,探討人參皂苷維持和增強(qiáng)老化神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用。方法1選取孕15-17天大鼠,采用機(jī)械分離胚鼠海馬NSCs的方法獲得原代NSCs,之后傳代培養(yǎng)。對(duì)NSCs進(jìn)行特異性標(biāo)志物Nestin鑒定,使用免疫熒光染色的方法。2CCK-8法篩選D-半乳糖致神經(jīng)干細(xì)胞體外老化模型的最佳濃度和最佳時(shí)間。設(shè)置6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h、48h、60h、72h),種6板,在每個(gè)板內(nèi)設(shè)Dmem組、對(duì)照組以及不同劑量組(5、10、15、20、25、30、35、40mg/ml),之后加CCK-8,1-4h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度,整理數(shù)據(jù),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3使用課題組前期用MTS法檢測(cè)NSCs細(xì)胞增殖能力篩選出的人參皂苷最佳劑量(lug/ml)及最佳作用時(shí)間(24h),采用CCk-8法檢測(cè)人參皂苷對(duì)D-半乳糖致神經(jīng)干細(xì)胞體外老化模型中老化神經(jīng)干細(xì)胞的影響。4使用Western Blot法檢測(cè)人參皂苷作用老化神經(jīng)干細(xì)胞后神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)SOX2和BMI-1蛋白的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)分為正常組、老化組和老化加人參皂苷組。首先對(duì)三組NSCs細(xì)胞提取蛋白,按照蛋白提取試劑盒操作指示進(jìn)行操作,制備蛋白樣品,SDS-PAGE電泳,敷一抗二抗,最后使用凝膠成像儀檢測(cè)目標(biāo)蛋白,使用Image Pro Plus7.0軟件對(duì)條帶結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。5免疫熒光及細(xì)胞核染色檢測(cè)正常神經(jīng)干細(xì)胞,老化神經(jīng)干細(xì)胞及人參皂苷作用老化神經(jīng)干細(xì)胞后神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)特異性標(biāo)志物Nestin,以及SOX2和BMI-1的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分為正常組、老化組、老化加人參皂苷組,在細(xì)胞培養(yǎng)、造模、加人參皂苷并進(jìn)行前期的免疫熒光常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作以后,加入相應(yīng)的Nestin、BMI-1、SOX2一抗二抗,加DAPI染色,封片后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記的細(xì)胞并拍照并通過(guò)Image Pro Plus7.0圖像分析軟件分析其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、面密度和光密度。結(jié)果1成功分離培養(yǎng)胚鼠海馬NSCs,并經(jīng)免疫熒光證明其表達(dá)NSCs特異性標(biāo)記物Nestin,可進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),純度為95%以上NSCs。2 D-半乳糖致神經(jīng)干細(xì)胞體外老化模型的最佳濃度劑量是35mg/ml,D-半乳糖致神經(jīng)干細(xì)胞體外老化模型的最佳時(shí)間是24h。3采用CCk-8法檢測(cè)人參皂苷對(duì)D-半乳糖致神經(jīng)干細(xì)胞體外老化模型中老化神經(jīng)干細(xì)胞的影響與正常組相比,老化組吸光值明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。同老化組相比,人參皂苷組吸光值明顯上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4Western Blot法檢測(cè)人參皂苷作用老化神經(jīng)干細(xì)胞后神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)SOX2和BMI-1蛋白的表達(dá)情況神經(jīng)干細(xì)胞正常組、老化組和人參皂苷組內(nèi)的SOX2和BMI-1蛋白均陽(yáng)性表達(dá)。神經(jīng)干細(xì)胞老化組與正常組相比,SOX2表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),神經(jīng)干細(xì)胞人參皂苷組與老化組相比,SOX2表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。神經(jīng)干細(xì)胞老化組與正常組相比,BMI-1表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),神經(jīng)干細(xì)胞老化加人參皂苷組與老化組相比,BMI-1表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。5免疫熒光及細(xì)胞核染色檢測(cè)正常神經(jīng)干細(xì)胞,老化神經(jīng)干細(xì)胞及人參皂苷作用老化神經(jīng)干細(xì)胞后神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)特異性標(biāo)志物Nestin,以及SOX2基因和BMI-1基因的表達(dá)情況NSCs正常組、NSCs老化組和NSCs人參皂苷組均有Nestin、SOX2、BMI-1陽(yáng)性表達(dá)。與NSCs正常組相比,NSCs老化組的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與NSCs老化組相比,NSCs人參皂苷組的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)結(jié)論D-半乳糖致神經(jīng)干細(xì)胞體外老化模型的最佳濃度劑量是35mg/ml,最佳時(shí)間是24h。人參皂苷可以促進(jìn)老化NSCs中SOX2和BMI-1表達(dá)增加,證明人參皂苷能維持和增強(qiáng)衰老神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性,與人參延緩腦老化的臨床作用密切相關(guān)。
【圖文】：

圖７：在不同時(shí)間點(diǎn)，同一濃度（３５ｍｇ／ｍｌ）邋Ｄ－ｇａｌ對(duì)ＮＳＣ＇ｓ吸光值的影響（ｘ土ｓ，邋ｎ二６）逡逑

４．邋２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測(cè)人參皂苷作用老化神經(jīng)干細(xì)胞后神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１逡逑蛋白的表達(dá)逡逑見(jiàn)表２，圖２、３，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行老化造模（３５ｍｇ／ｍｌＤ＿ｇａｌ作用２４ｈ）邋，邋ｌｕｇ／ｍｌ逡逑人參皂苷作用２４ｈ以后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１蛋白的表達(dá)逡逑情況，，由結(jié)果可知，神經(jīng)干細(xì)胞正常組、老化組和人參皂苷組內(nèi)的Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１蛋白逡逑均陽(yáng)性表達(dá)。神經(jīng)千細(xì)胞老化組與正常組相比，Ｓ０Ｘ２表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意逡逑義（ｐ＜０．邋０１），yL經(jīng)千細(xì)胞人參皂苷組與老化組相比，Ｓ０Ｘ２表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)逡逑學(xué)意義（Ｐ＜0．邋０５）。神經(jīng)干細(xì)胞老化組與正常組相比，ＢＭＩ－１表達(dá)明顯降低，差異具有逡逑統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜0．邋０１），神經(jīng)干細(xì)胞人參皂苷組與老化組相比，ＢＭＩ－１表達(dá)明顯升高，逡逑差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜0．邋０１）逡逑表２各組ＳＯＸ２蛋白的表達(dá)與內(nèi)參Ｐ－ａｃｔｉｎ的丨ＯＤ比值（Ｓ土ｓ
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;德揭示腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)制[J];生物學(xué)教學(xué);2017年01期

2 ;美發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞為RNA提供高速通道[J];生物學(xué)教學(xué);2017年05期

3 朱再滿(mǎn);神經(jīng)干細(xì)胞及其應(yīng)用展望[J];中學(xué)生物學(xué);2005年03期

4 把玉紅;神經(jīng)干細(xì)胞最新研究進(jìn)展[J];中學(xué)生物學(xué);2004年05期

5 張萍;湯永紅;;組蛋白去乙�；�酶參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究進(jìn)展[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志;2014年11期

6 王倩;范文濤;賀又舜;;地黃飲子含藥血清對(duì)胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響[J];中醫(yī)藥學(xué)報(bào);2015年01期

7 呂文龍;趙玉;徐鐵軍;;星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)醫(yī)藥指南;2015年18期

8 王軍;劉增良;秦向英;劉洋;于海明;;IGF-1誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的機(jī)制研究[J];人人健康;2016年22期

9 吳劍涓;蘇心;;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用研究[J];中華老年心腦血管病雜志;2013年04期

10 王亞周;Jennifer M.Plane;江鵬;;靜息和活化內(nèi)源性成年神經(jīng)干細(xì)胞:身份確認(rèn)與特性分析[J];醫(yī)學(xué)爭(zhēng)鳴;2012年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 姜靖;;神經(jīng)干細(xì)胞有助找回遺失的記憶:或能取自皮膚[A];《科學(xué)與現(xiàn)代化》2017年第1期（總第070期）[C];2017年

2 孫一睿;胡錦;王爾松;奚才華;姚海軍;;單層黏附培養(yǎng)技術(shù)在哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞體外穩(wěn)定增殖和多向分化中的應(yīng)用[A];中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)第四屆全國(guó)代表大會(huì)論文匯編[C];2009年

3 劉佳梅;;腦內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2009年

4 于龍剛;李娜;姜彥;解鳳陽(yáng);張曉雯;;貓胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定的研究[A];全國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科中青年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

5 夏立廣;李仲榮;劉淼清;王永飚;朱利斌;趙一鳴;;兩種不同來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)研究[A];2013年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)小兒外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨分會(huì)成立30周年慶典論文匯編[C];2013年

6 司銀楚;朱培純;程龍;吳海霞;許紅;;去皮層血管對(duì)成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的影響[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

7 李學(xué)坤;郭安臣;左萍萍;;胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及亞克隆[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十屆全國(guó)神經(jīng)學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省藥理學(xué)會(huì)2002年年會(huì)論文摘要集[C];2002年

8 李力;萬(wàn)琪;;小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及缺血神經(jīng)元對(duì)其增殖、分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

9 戴毅;韓忠朝;;神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展及臨床前景展望[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)第八屆組織學(xué)與胚胎學(xué)專(zhuān)業(yè)青年研討會(huì)論文集[C];2004年

10 徐群淵;;神經(jīng)干細(xì)胞的分離、純化和永生化[A];中國(guó)組織工程、干細(xì)胞與神經(jīng)再生學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 張建列 通訊員 黃博純;神經(jīng)干細(xì)胞分區(qū)分化調(diào)控機(jī)制研究獲進(jìn)展[N];廣東科技報(bào);2018年

2 記者 聶翠蓉;神經(jīng)干細(xì)胞為RNA提供高速通道[N];科技日?qǐng)?bào);2016年

3 記者 張建列 通訊員 朱丹萍;人尿可提取神經(jīng)干細(xì)胞[N];廣東科技報(bào);2012年

4 孫國(guó)根;阻礙卒中后神經(jīng)干細(xì)胞再生的“元兇”被發(fā)現(xiàn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2013年

5 特約記者 風(fēng)云;我國(guó)科學(xué)家成功培養(yǎng)出體外神經(jīng)干細(xì)胞[N];北京科技報(bào);2001年

6 鄭屠編譯;干細(xì)胞公司股票暴漲[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

7 孫國(guó)根　白毅;靈長(zhǎng)類(lèi)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2011年

8 嚴(yán)志明 肖鑫;恢復(fù)腦神經(jīng)功能有望[N];新華每日電訊;2000年

9 時(shí)仲省 高思敏 溫廷勇;癱瘓病人重新站立不再遙遠(yuǎn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2001年

10 江山;腦發(fā)育不全癲癇病人有望獲治[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2001年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王曉晴;神經(jīng)干細(xì)胞隧道納米管形成及對(duì)腦缺血再灌注模型保護(hù)作用研究[D];中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

2 陳旭鋒;PDGF-BB對(duì)艾滋病病毒和可卡因介導(dǎo)的神經(jīng)元分化損害修復(fù)機(jī)制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

3 張玲玲;何首烏活性成分二苯乙烯苷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化為DA能神經(jīng)元的作用及機(jī)制[D];中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

4 杜昭霞;2-溴棕櫚酸通過(guò)影響EID1蛋白表達(dá)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2018年

5 于曉雯;神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)缺血性卒中的保護(hù)機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

6 沈雪莉;新生大鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元過(guò)程中溶酶體與微管蛋白的相關(guān)性研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2004年

7 姬西團(tuán);人與小鼠神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 林欣;大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞共同培養(yǎng)及顱內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

9 趙慧英;神經(jīng)干細(xì)胞和皮膚干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

10 胡昕華;Neurotrophin 3及其高親和力受體TrkC在神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的功能和機(jī)制研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡俊;慢病毒介導(dǎo)解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)低表達(dá)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

2 李雯;miR-29a-5p在丙戊酸鈉誘導(dǎo)海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中的作用[D];南通大學(xué);2018年

3 李宇軒;人參皂苷維持衰老神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2019年

4 申一君;3D打印類(lèi)神經(jīng)組織的構(gòu)建及應(yīng)用[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2018年

5 陳濤;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子過(guò)表達(dá)的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠腦損傷模型的機(jī)制研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2018年

6 夏翔;BMP-Smad-Id2信號(hào)通路激活對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化影響的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

7 周瀟齊;成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細(xì)胞的提取及重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)其體外培養(yǎng)增殖、凋亡的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

8 常成;丙泊酚對(duì)成年大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

9 林瓊瑜;白介素-1β介導(dǎo)膿毒癥新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化異常的機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

10 徐蛟天;聯(lián)合移植過(guò)表達(dá)Nurr1基因的小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)改善帕金森大鼠運(yùn)動(dòng)障礙的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2593766