發(fā)布時間：2020-03-21 18:38

【摘要】：目的建立D-半乳糖致神經干細胞體外老化模型,人參皂苷干預老化神經干細胞以后,量化神經干細胞內維持生物學特性的兩個內源轉錄因子SOX2和BMI-1的表達變化,探討人參皂苷維持和增強老化神經干細胞生物學特性的作用。方法1選取孕15-17天大鼠,采用機械分離胚鼠海馬NSCs的方法獲得原代NSCs,之后傳代培養(yǎng)。對NSCs進行特異性標志物Nestin鑒定,使用免疫熒光染色的方法。2CCK-8法篩選D-半乳糖致神經干細胞體外老化模型的最佳濃度和最佳時間。設置6個不同時間點(6h、12h、24h、48h、60h、72h),種6板,在每個板內設Dmem組、對照組以及不同劑量組(5、10、15、20、25、30、35、40mg/ml),之后加CCK-8,1-4h后用酶標儀測定在450nm處的吸光度,整理數(shù)據(jù),繪制標準曲線。3使用課題組前期用MTS法檢測NSCs細胞增殖能力篩選出的人參皂苷最佳劑量(lug/ml)及最佳作用時間(24h),采用CCk-8法檢測人參皂苷對D-半乳糖致神經干細胞體外老化模型中老化神經干細胞的影響。4使用Western Blot法檢測人參皂苷作用老化神經干細胞后神經干細胞內SOX2和BMI-1蛋白的表達情況,實驗分為正常組、老化組和老化加人參皂苷組。首先對三組NSCs細胞提取蛋白,按照蛋白提取試劑盒操作指示進行操作,制備蛋白樣品,SDS-PAGE電泳,敷一抗二抗,最后使用凝膠成像儀檢測目標蛋白,使用Image Pro Plus7.0軟件對條帶結果進行分析統(tǒng)計。5免疫熒光及細胞核染色檢測正常神經干細胞,老化神經干細胞及人參皂苷作用老化神經干細胞后神經干細胞內特異性標志物Nestin,以及SOX2和BMI-1的表達情況。實驗分為正常組、老化組、老化加人參皂苷組,在細胞培養(yǎng)、造模、加人參皂苷并進行前期的免疫熒光常規(guī)實驗操作以后,加入相應的Nestin、BMI-1、SOX2一抗二抗,加DAPI染色,封片后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光標記的細胞并拍照并通過Image Pro Plus7.0圖像分析軟件分析其陽性細胞數(shù)、面密度和光密度。結果1成功分離培養(yǎng)胚鼠海馬NSCs,并經免疫熒光證明其表達NSCs特異性標記物Nestin,可進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),純度為95%以上NSCs。2 D-半乳糖致神經干細胞體外老化模型的最佳濃度劑量是35mg/ml,D-半乳糖致神經干細胞體外老化模型的最佳時間是24h。3采用CCk-8法檢測人參皂苷對D-半乳糖致神經干細胞體外老化模型中老化神經干細胞的影響與正常組相比,老化組吸光值明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。同老化組相比,人參皂苷組吸光值明顯上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4Western Blot法檢測人參皂苷作用老化神經干細胞后神經干細胞內SOX2和BMI-1蛋白的表達情況神經干細胞正常組、老化組和人參皂苷組內的SOX2和BMI-1蛋白均陽性表達。神經干細胞老化組與正常組相比,SOX2表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01),神經干細胞人參皂苷組與老化組相比,SOX2表達升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。神經干細胞老化組與正常組相比,BMI-1表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01),神經干細胞老化加人參皂苷組與老化組相比,BMI-1表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。5免疫熒光及細胞核染色檢測正常神經干細胞,老化神經干細胞及人參皂苷作用老化神經干細胞后神經干細胞內特異性標志物Nestin,以及SOX2基因和BMI-1基因的表達情況NSCs正常組、NSCs老化組和NSCs人參皂苷組均有Nestin、SOX2、BMI-1陽性表達。與NSCs正常組相比,NSCs老化組的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和陽性細胞數(shù)均顯著減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與NSCs老化組相比,NSCs人參皂苷組的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和陽性細胞數(shù)均增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)結論D-半乳糖致神經干細胞體外老化模型的最佳濃度劑量是35mg/ml,最佳時間是24h。人參皂苷可以促進老化NSCs中SOX2和BMI-1表達增加,證明人參皂苷能維持和增強衰老神經干細胞生物學特性,與人參延緩腦老化的臨床作用密切相關。
【圖文】：

圖７：在不同時間點，同一濃度（３５ｍｇ／ｍｌ）邋Ｄ－ｇａｌ對ＮＳＣ＇ｓ吸光值的影響（ｘ土ｓ，邋ｎ二６）逡逑

４．邋２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測人參皂苷作用老化神經干細胞后神經干細胞內Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１逡逑蛋白的表達逡逑見表２，圖２、３，對神經干細胞進行老化造模（３５ｍｇ／ｍｌＤ＿ｇａｌ作用２４ｈ）邋，邋ｌｕｇ／ｍｌ逡逑人參皂苷作用２４ｈ以后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測神經干細胞內Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１蛋白的表達逡逑情況，，由結果可知，神經干細胞正常組、老化組和人參皂苷組內的Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１蛋白逡逑均陽性表達。神經千細胞老化組與正常組相比，Ｓ０Ｘ２表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意逡逑義（ｐ＜０．邋０１），yL經千細胞人參皂苷組與老化組相比，Ｓ０Ｘ２表達升高，差異具有統(tǒng)計逡逑學意義（Ｐ＜0．邋０５）。神經干細胞老化組與正常組相比，ＢＭＩ－１表達明顯降低，差異具有逡逑統(tǒng)計學意義（Ｐ＜0．邋０１），神經干細胞人參皂苷組與老化組相比，ＢＭＩ－１表達明顯升高，逡逑差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜0．邋０１）逡逑表２各組ＳＯＸ２蛋白的表達與內參Ｐ－ａｃｔｉｎ的丨ＯＤ比值（Ｓ土ｓ
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2593766