發(fā)布時間：2020-03-21 18:30

【摘要】：桑樹黃酮主要以糖苷形式存在,具有抗氧化、降血壓等多種生物活性,是當(dāng)前蠶桑資源利用的研究熱點(diǎn)之一。然而,桑樹黃酮苷的生物活性與其糖基的種類與組成密切相關(guān),對其開展糖基定向改造的生物催化研究有望提高其活性、穩(wěn)定性及生物利用度。本文以α-L-鼠李糖苷酶(rhaB1)催化蘆丁的鼠李糖基定向水解制備異槲皮苷為模式體系,率先應(yīng)用雙啟動子表達(dá)載體制備綠色熒光蛋白標(biāo)記的示蹤催化劑,設(shè)計中空纖維膜反應(yīng)器和液滴微反應(yīng)器強(qiáng)化其生物轉(zhuǎn)化過程。主要研究內(nèi)容如下:(1)利用雙啟動子表達(dá)載體pRSFDuet1構(gòu)建重組Escherichia coli BL21-pRSFDuet1-rhaB1-EGFP,分析rhaB1-EGFP的酶學(xué)性質(zhì)及其表達(dá)量與熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:以四硝基甲苯-α-L-吡喃鼠李糖苷(pNPR)為底物測定酶活,rhaB1-EGFP粗酶液的最適溫度為40℃,比課題組前期利用pET21a載體在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)的rhaB1粗酶液降低了5℃,最適pH均為6.5。rhaB1-EGFP在40℃處理30 min后相對活力剩余95%,rhaB1在45℃下處理30 min后僅剩80%。rhaB1-EGFP的蛋白表達(dá)量與EGFP的熒光強(qiáng)度關(guān)系可以用方程Y=-3.1077×10~(-5)X2+0.03577X-1.82628表示,通過測量熒光強(qiáng)度即可計算rhaB1-EGFP的表達(dá)量。(2)分別以rhaB1-EGFP的粗酶液和全細(xì)胞為催化劑,考察其催化水解蘆丁制備異槲皮苷的工藝條件,并利用表面等離子共振(SPR)分析rhaB1以及rhaB1-EGFP對蘆丁的親和力。結(jié)果表明,粗酶液的最適催化溫度為40℃、最適pH為6.5、最適底物濃度為0.03 g/L,在此條件下反應(yīng)10 h產(chǎn)物最大得率為91.7±2.4%;全細(xì)胞最適催化溫度為40℃、最適pH為6.0、最適底物濃度為0.05g/L,在此條件下反應(yīng)2 h產(chǎn)物最大得率為92.5±4.8%;rhaB1-EGFP和rhaB1與蘆丁的平衡解離常數(shù)分別為8.7×10-6 mol·L-1和5.8×10-6 mol·L~(-1),差異不顯著(P0.05),表明兩種酶均能與底物高特異性結(jié)合。(3)以重組E.coli全細(xì)胞為催化劑構(gòu)建反應(yīng)分離耦合的聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜細(xì)胞反應(yīng)器,考察萃取劑與底物體積比、反應(yīng)溫度、pH、底物濃度對酶促水解蘆丁生成異槲皮苷的影響以及催化劑的重復(fù)利用度。結(jié)果表明,萃取劑與底物比為1:2時實(shí)現(xiàn)反應(yīng)分離耦合后產(chǎn)物的得率提高了1.8倍,優(yōu)化膜反應(yīng)器的工藝條件為:萃取劑:底物=3:4、溫度為40℃、pH為5.5、底物濃度為0.02g/L,反應(yīng)6 h產(chǎn)物最大得率為87.9±2.9%。利用1%(v/v)的HCl水溶液清洗反應(yīng)10 h的膜組件7次,膜通量可恢復(fù)75%。全細(xì)胞催化劑重復(fù)使用5次,相對酶活力仍然保持50%以上。(4)以rhaB1粗酶液為催化劑構(gòu)建W/O型液滴微反應(yīng)器,考察分散相和連續(xù)相壓力對液滴大小的影響,并對液滴微反應(yīng)器中酶催化水解蘆丁生成異槲皮苷的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,選擇流動聚焦型芯片(22.5 mm×15 mm,通道內(nèi)徑300μm),分散相與連續(xù)相壓力均為100 mbar時,形成的液滴最小,直徑為67.2±12.9μm;分散相與連續(xù)相壓力分別為150 mbar和125 mbar時,形成液滴最大,直徑為1485.25±46.41μm。經(jīng)單因素和響應(yīng)曲面法優(yōu)化液滴微反應(yīng)器內(nèi)酶催化工藝的最佳條件為:溫度為35℃、底物濃度為0.02 g/L,pH為5.5,此條件下產(chǎn)物的時空產(chǎn)率高達(dá)75.54μg/m_3/d。綜上所述,本文成功制備了熒光標(biāo)記的α-L-鼠李糖苷酶rhaB1-EGFP,與蘆丁結(jié)合具有與rhaB1無差異性的親和力。構(gòu)建的PVDF膜細(xì)胞反應(yīng)器與液滴微反應(yīng)器成功實(shí)現(xiàn)了高效的生物催化,為桑樹黃酮苷的糖基定向改造提供了新的思路和方法。
【圖文】：

也可降低肝臟中鋅、銅等金屬離子濃度或抑制造成肝臟組織損壞的酶活性從而保護(hù)肝皮素可以抑制涉及各種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 NF-kappaB 的產(chǎn)生，從而或減少炎癥的發(fā)生[4]，還可以抑制血管內(nèi)皮生長因子的生成、激活滑膜細(xì)胞端粒時促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的生長因子的生成，進(jìn)而預(yù)防血管翳的形成。異苷能夠增強(qiáng)胰高血糖素樣肽 1 的分泌，從而調(diào)節(jié)胰島素的分泌[5]，因此異槲皮苷用于調(diào)節(jié)葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。此外，黃酮還具有抗氧化的作用，可有效抑制和清除人產(chǎn)生的活性氧和自由基；具有抗真菌活性，可用作抗菌劑；具有抗病毒活性，如素、兒茶素和橙皮苷；對骨質(zhì)疏松、腫瘤等也具有一定的抑制作用。1.3 桑樹黃酮的提取制備桑樹黃酮的傳統(tǒng)提取方法主要有索氏提取、水蒸氣蒸餾、溶劑提取等，存在一限制，如萃取時間較長，對溶劑純度、萃取劑選擇性要求較高，導(dǎo)致成本高，同量的溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生的三廢治理也加劇了工藝成本。為了克服這些問題并滿足不同的需求，更多非常規(guī)的技術(shù)被開發(fā)和應(yīng)用（見圖 1.1）。

江蘇科技大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文持較大的膜通量以持續(xù)利用顯得尤為重要。膜污染是由多種原因引起、非常復(fù)雜的現(xiàn)象，混合物中絮凝物、膠體及溶質(zhì)的大小都會影響膜的過濾系統(tǒng)。如果污垢與膜孔大小相當(dāng)，或比膜孔小，則可能發(fā)生孔壁上的吸附和孔堵塞；而當(dāng)污垢比膜孔大時，則可能在膜表面形成濾餅層，進(jìn)而阻礙膜分離過程。如圖 1.2 所示，，膜反應(yīng)器中污垢的形成及去除過程比較復(fù)雜。通常，污垢由松散附著的雜質(zhì)引起，大多情況下通過反洗等物理清洗可以去除，而對于由過濾過程中膜孔堵塞和強(qiáng)附著雜質(zhì)則需要化學(xué)清潔方法才能去除。一旦形成不可逆污垢，便是永久性污垢，難以將其清除，導(dǎo)致膜的無法使用。因此，為了延長膜的使用效率，需對膜反應(yīng)器進(jìn)行定期清洗。
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284

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