發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 18:38

　　 目的:本研究通過實(shí)驗(yàn)探究驗(yàn)證Chelex-100聯(lián)合吸附柱法提取指甲游離緣DNA的可行性,分析各種影響因素對(duì)指甲游離緣DNA提取與STR分型的影響結(jié)果以建立指甲游離緣最佳的提條件;在最佳提取條件下,通過大量樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其可行性。通過大量樣本DNA濃度的數(shù)據(jù)分析對(duì)指甲游離緣DNA含量進(jìn)行定量分析,來確定其含量。方法:指甲游離緣DNA提取采用去離子水與10%SDS緩沖液清洗結(jié)合無菌手術(shù)刀刮取等方法清潔與粉碎指甲游離緣,利用Chelex-100與吸附柱聯(lián)合提取指甲游離緣DNA,利用5色熒光Powerplex(?)21 System PCR擴(kuò)增試劑盒、96孔梯度PCR擴(kuò)增儀和ABI 3100-Avant基因分析儀分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因分型。設(shè)指甲游離緣的干燥時(shí)間(5min、7min、10min、12min、15min、17min)、消化時(shí)間(2h、6h、10h、14h、18h、24h)、質(zhì)量(3mg、10mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg)、厚度(0.35mm、0.40mm、0.45mm、0.50mm、0.55mm、0.60mm)、Chelex-100 濃度(1%Chelex-100、2.5%Chelex-100、5%Chelex-100、7.5%Chelex-100、10%Chelex-100)作為影響因素,建立最佳提取條件。在最佳提取條件下對(duì)正常樣本(50份),涂有指甲油的樣本(6份)與腳趾甲樣本(6份)進(jìn)行提取與基因分型。利用Nanodrop2000對(duì)50個(gè)指甲游離緣樣本進(jìn)行DNA濃度測(cè)量,確定指甲游離緣內(nèi)部DNA含量;利用5%Chelex-100對(duì)50人靜脈血液樣本(對(duì)照)進(jìn)行提取;利用GeneMapperID v3.2基因分析軟件、EXCEL 2007及SPSS 21.0進(jìn)行基因分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:用Chelex-100聯(lián)合吸附柱法成功提取高質(zhì)量的指甲游離緣DNA,采用最佳的DNA提取條件,成功檢測(cè)到所有基因座的分型。在干燥時(shí)間影響因素中,5分鐘以上DNA圖譜完整,無等位基因缺失,RFU值與干燥時(shí)間成正相關(guān),當(dāng)干燥時(shí)間超過15分鐘時(shí)TH01,VWA,D8S1179,D12S391基因座會(huì)出現(xiàn)較多雜峰,故選擇干燥時(shí)間10分鐘為最佳干燥時(shí)間;在消化時(shí)間影響因素中,時(shí)間為2h,6h,10h時(shí)分別缺失2、1、1個(gè)等位基因,2h時(shí)還伴有Amelogenin基因座不平衡峰的出現(xiàn),14h時(shí)基因座PENTAE,PENTAD有不平衡峰出現(xiàn),18h,24h無等位基因缺失,等位基因峰均衡性好,24h基因座基因RFU值峰值最高,故選擇24h為最佳消化時(shí)間;在質(zhì)量影響因素中,質(zhì)量為3mg,10mg時(shí)分別缺失17個(gè),12個(gè)等位基因,在14mg以上時(shí)顯示完整的基因圖譜,峰型穩(wěn)定;厚度影響因素中,0.35mm、0.40mm厚度的指甲樣品中存在分別缺失5個(gè)和1個(gè)等位基因的現(xiàn)象,0.45mm開始出現(xiàn)完整的圖譜;在Chelex-100濃度影響因素中,Chelex-100濃度為1%,2.5%時(shí)DNA-STR分型圖譜中分別缺失22,16個(gè)等位基因,Chelex-100濃度在5%以上時(shí)DNA-STR分型圖譜完整無等位基因缺失。利用7.5%Chelex-100提取的DNA濃度最高,STR分型圖譜與10%Chelex-100圖譜相差無幾,故Chelex-100濃度為7.5%-10%時(shí)最佳。50份樣本指甲游離緣樣本、6份涂有指甲油的樣本和6份腳趾甲樣本在此種方法最佳條件下成功提取DNA并進(jìn)行STR基因分型,50份樣本指甲游離緣樣本與靜脈血對(duì)照組DNA分型完全一致。指甲游離緣內(nèi)含有的DNA量大約是28.15±5.81ng/mg。結(jié)論:Chelex-100聯(lián)合吸附柱可行并且適合指甲游離緣DNA提取;通過本研究,確定最終最佳DNA提取條件確定為質(zhì)量14mg以上、厚度0.45mm以上、消化時(shí)間24h、100℃干燥1Omin、Chelex-100濃度為7.5%-10%;本研究結(jié)果為人類指甲游離緣DNA的法醫(yī)學(xué)鑒定提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：D919
【部分圖文】：

３．１各個(gè)影響因素下ＳＴＲ分型圖譜結(jié)果??運(yùn)用基因分析軟件ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ?ＩＤ?ｖ３．２得到不同影響因素的基因圖譜。??Ａ組不同的干燥時(shí)間的電泳結(jié)果見圖１－圖６，?１０（ＴＣ干燥條件下不同干燥時(shí)間??等位基因無缺失，從表２，圖７可以看出，隨著時(shí)間的增長各個(gè)基因座下的ＲＦＵ??值也變大，ｌ〇〇°Ｃ?１５分鐘時(shí)處于圖的最頂端其次是１７分鐘時(shí)。綠色折線（１００°Ｃ??１０分鐘）大約處于折線圖的中間，ｌ〇〇°Ｃ?５分鐘的折線圖基本處于折線圖的最底??端；小片段基因座?Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、ＴＨ０１、Ｄ８Ｓ１１７９??的ＲＦＵ值處于２０００－７０００之間，Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２Ｓ１３３８、ＣＳＦ１Ｐ０、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ８Ｓ１１７９、??Ｄ１２Ｓ３９１?的?ＲＦＵ?值處于?１０００?左右，大片段?ＰＥＮＴＡＥ、ＰＥＮＴＡＤ、ＴＰＯＸ、ＦＧＡ??的ＲＦＵ均值約５５０。當(dāng)干燥時(shí)間超過１５分鐘時(shí)ＴＨ０１、ＶＷＡ、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１２Ｓ３９１??基因座會(huì)出現(xiàn)較多雜峰。??ｔｏｏ?ＺＯＯ?３００?４００??７０００?＊??１００：Ｌ?Ｉ?ＩａＡ?；?１１．??匕??：??ｉｉ?Ｈｉ?ｉｓ?ｉｌ?Ｓ?窗??ｉ．ｆｓａ?ＳｍｉＡ?Ｐｉｈｊ４ｉ＃＊ＰＩ＊ｘ＿Ｚ１＿ｗ２－０?ｉ?ｇ??切ＳＳＳ３９?ｇ＞２Ｓ１３３８?．?????＂：?；??１０Ｑ?２００?３００?４〇ａ??ｉ?

表２：?１００°Ｃ千燥時(shí)間下各基因座ＲＦＵ峰值??１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ?１００°Ｃ￣??５?ｍｉｎ?７ｍｉｎ?ｌＯｍｉｎ?Ｉ２ｍｉｎ?Ｉ５ｍｉｎ?Ｉ７ｍｉｎ??Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ?２２３４?３５８１?３５９７?２５８０?６６０７?６３５４＾??１９５２?３６５６?３８７８?２５８０?６７３８?６２０４??Ｄ３Ｓ１３５８?１３０９?２２１８?１７２７?２４６４?５４２９?４５５９??２１６８?３３６５?２８４９?３０２７?６６０７?４００１??Ｄ１Ｓ１６５６?１０６７?８９８?１２１０?１４６９?２７２１?２４９３??８７０?８６６?７７５?６７５?２７２１?１３８８??Ｄ６Ｓ１０４３?６３９?１１０６?９８５?９１８?２３２５?２０２９??５６９?８２７?１０６４?６３６?２１２７?１６０２??Ｄ１３Ｓ３１７?６３３?４３３?１０３８?９３５?２３２５?１９５８??６３３?４３３?１０３８?９３５?２３２５?１９５８??ＰＥＮＴＡＥ?１４３?２０５?４３３?３５２?６７２?７５７??

延邊大學(xué)碩士學(xué)位論文?結(jié)果??■?＿＿?＿．＾？Ｓ？＊Ｔ＞３Ｄ???．．．．．ｆＪＩＭｌＪｔｔ?ｔ?．?ＪＪ＿?０－＊ＳＭｍｔ＊Ｋ???．．???＿＿＿＿＿．???Ｊ??ＩＯＯ?２００?３００???４〇Ｃ???
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2886527