發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 12:21

　　 目的失重或模擬失重條件下可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞對氧自由基(ROS)產(chǎn)生增加,清除能力下降,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能異常。內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能完整性對失重血管功能調(diào)節(jié)、防止動(dòng)脈硬化的發(fā)生至關(guān)重要,而microRNAs(miRNAs)廣泛參與了內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能重構(gòu)的調(diào)節(jié)。本研究通過細(xì)胞回轉(zhuǎn)模擬失重,探索EA.hy926細(xì)胞(HUVEC與肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的融合物)氧化應(yīng)激后差異表達(dá)的miRNAs及其意義。方法1.將EA.hy926細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶,將細(xì)胞分為對照組(C組)、對照氧化應(yīng)激組(C+H_2O_2組)、模擬失重組(Z組)和模擬失重后氧化應(yīng)激組(Z+H_2O_2組)四組。Z、Z+H_2O_2組裝滿細(xì)胞培養(yǎng)基,固定在細(xì)胞回轉(zhuǎn)器上,設(shè)定30轉(zhuǎn)/分37℃回轉(zhuǎn)培養(yǎng)72小時(shí);將C、C+H_2O_2組同樣灌滿培養(yǎng)液放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng);培養(yǎng)完畢后將所有細(xì)胞更換5ml/瓶新鮮培養(yǎng)液,用終濃度50mmol/L的過氧化氫刺激細(xì)胞C+H_2O_2、Z+H_2O_2組5小時(shí),然后收集細(xì)胞以備后續(xù)實(shí)驗(yàn);2.采用二代測序技術(shù)對C、C+H_2O_2、Z和Z+H_2O_2四組細(xì)胞進(jìn)行miRNA測序,通過測序技術(shù)篩選不同組別間差異表達(dá)的miRNAs,采用相對定量法對各組別間共同差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證;3.對經(jīng)qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)與miRNA測序趨勢一致的差異miRNAs展開生物信息學(xué)分析,通過生物信息學(xué)分析,了解差異表達(dá)miRNAs靶基因的顯著功能富集、顯著信號(hào)通路、蛋白互作關(guān)系;并對處于蛋白互作關(guān)系中的核心蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。結(jié)果通過顯著水平P0.05及差異倍數(shù)log2FC2或-2篩選差異表達(dá)miRNAs,C+H_2O_2 vs C有102個(gè)差異表達(dá)miRNAs,其中53個(gè)基因表達(dá)上調(diào),49個(gè)基因表達(dá)下調(diào);Z vs C中97個(gè)差異miRNSs(17個(gè)基因表達(dá)上調(diào),80個(gè)基因表達(dá)下調(diào));Z+H_2O_2 vs Z中71個(gè)差異miRNSs(52個(gè)基因表達(dá)上調(diào),19個(gè)基因表達(dá)下調(diào));Z+H_2O_2 vs C+H_2O_2中66個(gè)差異miRNSs(38個(gè)基因表達(dá)上調(diào),28個(gè)基因表達(dá)下調(diào))。RT-qPCR結(jié)果顯示,與C+H_2O_2組相比,Z+H_2O_2組hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表達(dá)增加,與miRNA測序結(jié)果一致。hsa-miR-29b-3p靶基因?yàn)镋RCC6、NFIA、TET3、BRWD3、FBN1、TET1、ATAD2B、RNF19A等,hsa-miR-200c-3p靶基因?yàn)锳POO、OSTM1、PAIP2、SULF1、KIAA1432、KDR、BAP1、DGKA、KLF4等。GO功能分析顯示二者富集于生物學(xué)粘附等生物過程,細(xì)胞連接等細(xì)胞組分、細(xì)胞結(jié)合等分子功能亞層。KEGG通路顯示hsa-miR-29b-3p靶基因顯著富集于局部黏附等信號(hào)通路,hsa-miR-200c-3p靶基因顯著富集于癌癥通路等信號(hào)通路。STRING蛋白互作分析結(jié)果表明hsa-miR-29b-3p靶基因中COL家族蛋白處于互作的關(guān)鍵位置,hsa-miR-200c-3p靶基因中RHOA處于互做的關(guān)鍵位置,經(jīng)Western blot驗(yàn)證核心蛋白R(shí)HOA,BCL-2在Z+H_2O_2 vs C中具有顯著表達(dá)趨勢。結(jié)論模擬失重下氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞包括hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-200c-3p在內(nèi)的miRNAs表達(dá)出現(xiàn)顯著差異,并通過對差異表達(dá)miRNAs靶基因及信號(hào)通路的調(diào)控參與失重條件下內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的特異性調(diào)節(jié)。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R85
【部分圖文】：

miRNA測序流程圖

miRNAs 與氧化應(yīng)激情況下失重環(huán)境對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生相關(guān)，后續(xù)將對其靶基因展開生物信息分析。圖2 模擬失重和氧化應(yīng)激后EA.hy926細(xì)胞中hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表達(dá)變化注:*P<0.05, **P<0.01, ***表示P<0.001，n=12。討 論隨著科學(xué)研究中對低成本測序的高需求推動(dòng)了高通量第二代測序技術(shù)的發(fā)展，因該技術(shù)使測序過程并行化，可同時(shí)產(chǎn)生數(shù)千或數(shù)百萬個(gè)基因序列[24]。是研究miRNA對生物學(xué)影響的有力工具。但該技術(shù)還存在下述缺點(diǎn)：進(jìn)行堿基替換的步驟及讀取長度在200bp-500bp的堿基長度時(shí)易產(chǎn)生測序錯(cuò)誤，使測序結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，降低了測序結(jié)果的可信度。熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度、特異度較高的優(yōu)點(diǎn)，其技術(shù)原理是通過熒光信號(hào)與目的產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關(guān)系計(jì)算基因的表達(dá)量，在本實(shí)驗(yàn)中可精確檢測miRNAs表達(dá)量。因此，本課題對經(jīng)miRNA測序篩選出的有意義的差異表達(dá)的miRNAs

圖3 miR-29b-3p、miR-200c-3p靶基因富集的生物過程（二）細(xì)胞組分（Cellular Component）miR-29b-3p 和 miR-200c-3p 差異基因功能富集分析分別得到到 8 個(gè)細(xì)胞組分亞層（圖 4）。這 2 個(gè) miRNAS 的差異表達(dá)基因均顯著富集于：細(xì)胞連接
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本文編號(hào)：2870093