目的失重或模擬失重條件下可引起血管內(nèi)皮細胞對氧自由基(ROS)產(chǎn)生增加,清除能力下降,導致氧化應激反應增強從而誘導內(nèi)皮細胞功能異常。內(nèi)皮細胞的結構、功能完整性對失重血管功能調(diào)節(jié)、防止動脈硬化的發(fā)生至關重要,而microRNAs(miRNAs)廣泛參與了內(nèi)皮細胞結構功能重構的調(diào)節(jié)。本研究通過細胞回轉(zhuǎn)模擬失重,探索EA.hy926細胞(HUVEC與肺癌細胞系A549的融合物)氧化應激后差異表達的miRNAs及其意義。方法1.將EA.hy926細胞接種在細胞培養(yǎng)瓶,將細胞分為對照組(C組)、對照氧化應激組(C+H_2O_2組)、模擬失重組(Z組)和模擬失重后氧化應激組(Z+H_2O_2組)四組。Z、Z+H_2O_2組裝滿細胞培養(yǎng)基,固定在細胞回轉(zhuǎn)器上,設定30轉(zhuǎn)/分37℃回轉(zhuǎn)培養(yǎng)72小時;將C、C+H_2O_2組同樣灌滿培養(yǎng)液放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中同時進行培養(yǎng);培養(yǎng)完畢后將所有細胞更換5ml/瓶新鮮培養(yǎng)液,用終濃度50mmol/L的過氧化氫刺激細胞C+H_2O_2、Z+H_2O_2組5小時,然后收集細胞以備后續(xù)實驗;2.采用二代測序技術對C、C+H_2O_2、Z和Z+H_2O_2四組細胞進行miRNA測序,通過測序技術篩選不同組別間差異表達的miRNAs,采用相對定量法對各組別間共同差異表達的miRNAs進行RT-qPCR驗證;3.對經(jīng)qPCR驗證差異表達與miRNA測序趨勢一致的差異miRNAs展開生物信息學分析,通過生物信息學分析,了解差異表達miRNAs靶基因的顯著功能富集、顯著信號通路、蛋白互作關系;并對處于蛋白互作關系中的核心蛋白進行Western blot驗證。結果通過顯著水平P0.05及差異倍數(shù)log2FC2或-2篩選差異表達miRNAs,C+H_2O_2 vs C有102個差異表達miRNAs,其中53個基因表達上調(diào),49個基因表達下調(diào);Z vs C中97個差異miRNSs(17個基因表達上調(diào),80個基因表達下調(diào));Z+H_2O_2 vs Z中71個差異miRNSs(52個基因表達上調(diào),19個基因表達下調(diào));Z+H_2O_2 vs C+H_2O_2中66個差異miRNSs(38個基因表達上調(diào),28個基因表達下調(diào))。RT-qPCR結果顯示,與C+H_2O_2組相比,Z+H_2O_2組hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表達增加,與miRNA測序結果一致。hsa-miR-29b-3p靶基因為ERCC6、NFIA、TET3、BRWD3、FBN1、TET1、ATAD2B、RNF19A等,hsa-miR-200c-3p靶基因為APOO、OSTM1、PAIP2、SULF1、KIAA1432、KDR、BAP1、DGKA、KLF4等。GO功能分析顯示二者富集于生物學粘附等生物過程,細胞連接等細胞組分、細胞結合等分子功能亞層。KEGG通路顯示hsa-miR-29b-3p靶基因顯著富集于局部黏附等信號通路,hsa-miR-200c-3p靶基因顯著富集于癌癥通路等信號通路。STRING蛋白互作分析結果表明hsa-miR-29b-3p靶基因中COL家族蛋白處于互作的關鍵位置,hsa-miR-200c-3p靶基因中RHOA處于互做的關鍵位置,經(jīng)Western blot驗證核心蛋白RHOA,BCL-2在Z+H_2O_2 vs C中具有顯著表達趨勢。結論模擬失重下氧化應激可誘導EA.hy926內(nèi)皮細胞包括hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-200c-3p在內(nèi)的miRNAs表達出現(xiàn)顯著差異,并通過對差異表達miRNAs靶基因及信號通路的調(diào)控參與失重條件下內(nèi)皮細胞生理功能的特異性調(diào)節(jié)。
【學位單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R85
【部分圖文】：

miRNA測序流程圖

miRNAs 與氧化應激情況下失重環(huán)境對內(nèi)皮細胞凋亡發(fā)生相關，后續(xù)將對其靶基因展開生物信息分析。圖2 模擬失重和氧化應激后EA.hy926細胞中hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表達變化注:*P<0.05, **P<0.01, ***表示P<0.001，n=12。討 論隨著科學研究中對低成本測序的高需求推動了高通量第二代測序技術的發(fā)展，因該技術使測序過程并行化，可同時產(chǎn)生數(shù)千或數(shù)百萬個基因序列[24]。是研究miRNA對生物學影響的有力工具。但該技術還存在下述缺點：進行堿基替換的步驟及讀取長度在200bp-500bp的堿基長度時易產(chǎn)生測序錯誤，使測序結果易出現(xiàn)假陽性，降低了測序結果的可信度。熒光定量PCR技術具有靈敏度、特異度較高的優(yōu)點，其技術原理是通過熒光信號與目的產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關系計算基因的表達量，在本實驗中可精確檢測miRNAs表達量。因此，本課題對經(jīng)miRNA測序篩選出的有意義的差異表達的miRNAs

圖3 miR-29b-3p、miR-200c-3p靶基因富集的生物過程（二）細胞組分（Cellular Component）miR-29b-3p 和 miR-200c-3p 差異基因功能富集分析分別得到到 8 個細胞組分亞層（圖 4）。這 2 個 miRNAS 的差異表達基因均顯著富集于：細胞連接
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本文編號：2870093