發(fā)布時(shí)間：2019-02-15 10:32

【摘要】：目的:腫瘤組織樣本是法醫(yī)檢案中常會(huì)遇到的一類(lèi)特殊的疑難生物檢材,其本身具有基因突變的特性,且大部分都是經(jīng)過(guò)福爾馬林固定石蠟包埋保存,極易發(fā)生DNA降解。而法醫(yī)學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)的STR在腫瘤組織突變率較高,且擴(kuò)增片段較長(zhǎng)容易發(fā)生等位基因丟失,使得傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)STR方法已不再適用于腫瘤組織的檢測(cè)。與STR相比,SNP突變率較低,擴(kuò)增片段短。因此,本研究旨在探討腫瘤組織的SNP突變規(guī)律,繼而比較福爾馬林固定的降解腫瘤組織的SNP與STR的檢出率,并初步探索二代測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)腫瘤組織中的應(yīng)用價(jià)值,為法醫(yī)檢案中檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織選擇遺傳標(biāo)記以及檢測(cè)技術(shù)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1樣本采集:本實(shí)驗(yàn)中所使用的樣本為本室保存的124例腫瘤組織,包括85例消化道系統(tǒng)、16例泌尿系統(tǒng)、13例呼吸系統(tǒng)、10例頭頸部的腫瘤組織及癌旁正常組織。所用的24例降解樣本是福爾馬林固定、-20℃保存五年的組織提取的DNA,包括12例消化道系統(tǒng)腫瘤組織及其癌旁正常組織。2 DNA提取:用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取上述124例腫瘤組織及正常組織DNA,采用ND-1000蛋白核酸定量?jī)x定量。用Gene Read TM DNA FFPE試劑盒提取24例經(jīng)福爾馬林固定的組織樣本DNA,采用Quantifiler?Trio DNA定量試劑盒在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量,得到樣本濃度及降解系數(shù)。3 SNP分型:采用55個(gè)SNPs SNaPshot復(fù)合分型體系進(jìn)行SNP分型,ABI 3130基因分析儀電泳,使用Gene Mapper ID v3.2軟件分析結(jié)果,得到腫瘤組織、正常組織的SNP分型。比對(duì)來(lái)自同一個(gè)體的正常組織和腫瘤組織的SNP分型結(jié)果,記錄突變的位點(diǎn)和突變類(lèi)型。4 SNP突變位點(diǎn)驗(yàn)證:采用單位點(diǎn)擴(kuò)增SNaPshot、Sanger測(cè)序方法對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。5 STR分型:采用Power Plex?21試劑盒擴(kuò)增降解樣本的20個(gè)常染色體STR基因座,ABI 3130基因分析儀進(jìn)行電泳,使用Gene Mapper ID v3.2軟件分析結(jié)果,得到24例降解樣本的STR分型。6 STR單個(gè)基因座檢測(cè):對(duì)疑似突變的STR基因座采用單個(gè)STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。7 Miseq FGx測(cè)序:采用Foren Seq TM DNA Signature Prep試劑盒(DNA引物混合液A)在Miseq FGx測(cè)序平臺(tái)對(duì)24例降解樣本進(jìn)行測(cè)序,包括27個(gè)常染色體STR、24個(gè)Y-STR、7個(gè)X-STR、94個(gè)個(gè)體識(shí)別SNP,用Foren SeqTMUAS V1.2.16347法醫(yī)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用Excel、SPSS v21.0軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用χ2檢驗(yàn)比較消化道腫瘤與其他類(lèi)型腫瘤之間SNP突變的差異。用直線相關(guān)對(duì)STR基因座片段大小與等位基因檢出率、樣本降解系數(shù)與等位基因檢出率進(jìn)行相關(guān)性分析。用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)Miseq FGx測(cè)序結(jié)果中STR與SNP的平均測(cè)序深度、平均雜合比值、基因座的構(gòu)成比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。用秩和檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)比較降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本之間STR與SNP測(cè)序深度、雜合比值、基因座構(gòu)成比的差異。用直線相關(guān)分析方法分析STR和SNP測(cè)序深度與片段長(zhǎng)度、測(cè)序深度與樣本降解系數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果:1腫瘤組織的SNP突變分析85例消化道腫瘤樣本、16例泌尿系統(tǒng)腫瘤樣本、13例呼吸系統(tǒng)腫瘤樣本、10例頭頸部腫瘤樣本經(jīng)SNaPshot復(fù)合分型體系分型后,共發(fā)現(xiàn)49個(gè)疑似突變位點(diǎn)。之后對(duì)49個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了單位點(diǎn)SNaPshot驗(yàn)證,結(jié)果顯示共3例樣本4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變,1例消化道腫瘤樣本的(rs9905977:C/T→T,rs722290:C/G→G),2例泌尿系統(tǒng)腫瘤樣本(rs7041158:C/T→C)(rs10092491:C/T→C),均表現(xiàn)為雜合性丟失。對(duì)四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證,1例泌尿系統(tǒng)腫瘤樣本rs7041158測(cè)序失敗,其余三個(gè)位點(diǎn)測(cè)序成功,均表現(xiàn)為雜合性丟失,與單位點(diǎn)SNaPshot驗(yàn)證結(jié)果一致。用χ2檢驗(yàn)對(duì)消化道腫瘤與其他類(lèi)型腫瘤的SNP突變率差異進(jìn)行比較分析,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。對(duì)腫瘤組織SNP突變率與本實(shí)驗(yàn)室前期檢測(cè)的STR突變率進(jìn)行比較,在樣本與基因座水平SNP突變率均明顯低于STR突變率,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2降解組織SNP與STR檢出率比較采用Quantifiler?Trio DNA定量試劑盒在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對(duì)24例福爾馬林固定存放五年的組織樣本DNA的降解系數(shù)及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示,除1例樣本的降解系數(shù)小于1外,其余23例樣本降解系數(shù)范圍為1.01~8.57,發(fā)生不同程度的降解。此24例存放五年的組織樣本與其在福爾馬林固定24小時(shí)內(nèi)提取的DNA檢測(cè)結(jié)果相比,SNP分型完全一致,檢出率為100%;而STR檢測(cè)結(jié)果顯示共發(fā)生13個(gè)基因座等位基因完全丟失,7個(gè)基因座發(fā)生等位基因雜合性丟失,這些發(fā)生等位基因丟失的樣本大部分降解較嚴(yán)重,降解系數(shù)大于2.6,且75.8%丟失等位基因的片段長(zhǎng)度大于300bp。對(duì)STR基因座片段長(zhǎng)度與等位基因檢出率之間進(jìn)行相關(guān)性分析,呈負(fù)相關(guān)(r=-0.629,P0.05),隨著檢測(cè)片段長(zhǎng)度增長(zhǎng),STR基因座檢出率逐漸下降。除兩例樣本降解系數(shù)較小卻發(fā)生等位基因丟失外,其余樣本降解系數(shù)與等位基因檢出率之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.659,P0.05),即DNA樣本降解系數(shù)越大,STR等位基因檢出率越低。3 Miseq FGx測(cè)序結(jié)果分析12例降解的腫瘤樣本STR基因座(Amel除外)平均測(cè)序深度為2384×(±1884×),平均雜合比值為0.61(±0.13),等位基因所占比例為0.92(0.81~1.00),stutter所占比例為0.06(0.00~0.13),noise所占比例為0.02(0.00~0.07)。12例降解的正常樣本STR基因座(Amel除外)平均測(cè)序深度為2158×(±1710×),平均雜合比值0.73(±0.11),等位基因所占比例為0.92(0.81~1.00),stutter所占比例為0.06(0.00~0.13),noise所占比例為0.02(0.00~0.07)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本在STR基因座平均測(cè)序深度、等位基因、stutter、noise所占比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而正常樣本的基因座平均雜合比值高于腫瘤樣本,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本STR基因座平均測(cè)序深度與基因座片段長(zhǎng)度之間呈負(fù)相關(guān),即隨著基因座片段長(zhǎng)度增加,STR基因座平均測(cè)序深度降低。降解的腫瘤樣本樣本STR測(cè)序深度與樣本降解系數(shù)之間無(wú)相關(guān)性,降解正常樣本樣本STR測(cè)序深度與樣本降解系數(shù)之間呈負(fù)相關(guān)。12例降解的腫瘤樣本SNP位點(diǎn)平均測(cè)序深度741×(±661×),平均雜合比值0.61(±0.12),等位基因所占比例為0.9998(0.9925~1.0000),noise所占比例為0.0002(0.0000~0.0075)。12例降解的正常樣本SNP位點(diǎn)平均測(cè)序深度633×(±552×),平均雜合比值0.77(±0.12),等位基因所占比例為0.9995(0.9892~1.0000),noise所占比例為0.0005(0.0000~0.0108)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本SNP位點(diǎn)平均測(cè)序深度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。SNP位點(diǎn)平均雜合比值、SNP位點(diǎn)等位基因、noise所占比例均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。降解的腫瘤樣本和降解的正常樣本SNP位點(diǎn)平均測(cè)序深度與SNP位點(diǎn)片段長(zhǎng)度之間呈負(fù)相關(guān),即隨著SNP位點(diǎn)片段長(zhǎng)度增加,SNP位點(diǎn)平均測(cè)序深度降低。樣本SNP測(cè)序深度與樣本降解系數(shù)之間無(wú)相關(guān)性。24例降解樣本在Miseq測(cè)序平臺(tái)與CE平臺(tái)檢測(cè)的Power Plex?21試劑盒進(jìn)行STR一致性研究。結(jié)果顯示除16例樣本共24個(gè)基因座分型結(jié)果不一致外,其余基因座檢測(cè)結(jié)果一致。有21個(gè)基因座檢測(cè)出基因亞型,3個(gè)基因座比CE多檢測(cè)出一個(gè)新的等位基因。針對(duì)降解DNA,Miseq測(cè)序平臺(tái)和CE檢測(cè)均顯示有大片段等位基因丟失現(xiàn)象,二者的等位基因檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Miseq檢測(cè)中有Penta E和D12S391兩個(gè)基因座共30個(gè)等位基因丟失,主要表現(xiàn)為Penta E等位基因丟失,占未檢出等位基因的93.33%,其片段長(zhǎng)度為362bp~467bp。CE檢測(cè)中有11個(gè)基因座共33個(gè)等位基因丟失,75.8%丟失等位基因的片段長(zhǎng)度大于300bp。24例降解樣本進(jìn)行55個(gè)SNPs的SNaPshot復(fù)合分型和Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行SNP一致性研究,兩個(gè)試劑盒共有43個(gè)相同位點(diǎn)。比較兩種方法的結(jié)果顯示共有5個(gè)SNPs的分型不一致,其中2個(gè)SNPs的SNaPshot分型結(jié)果丟失一個(gè)等位基因,3個(gè)SNPs的Miseq檢測(cè)結(jié)果丟失一個(gè)等位基因。兩種方法的等位基因檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1腫瘤組織SNP的突變率明顯低于STR,SNP更適合于腫瘤組織的個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定。2長(zhǎng)期福爾馬林固定的組織易發(fā)生降解,SNP比STR在降解腫瘤組織檢驗(yàn)中更具優(yōu)勢(shì)。3與SNPs SNaPshot分析方法相比,Miseq FGx測(cè)序平臺(tái)對(duì)于腫瘤樣本和降解檢材的檢測(cè)顯示出了更高的靈敏度,測(cè)序數(shù)據(jù)具有一定準(zhǔn)確性和可靠性,可以作為腫瘤樣本檢測(cè)時(shí)的一個(gè)有效方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：D919.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2423248