丙烯酰胺(acrylamide,ACR)是一種水溶性烯烴,作為化工原料生產(chǎn)聚丙烯酰胺。ACR的神經(jīng)毒性在人群流行病學(xué)研究中得到充分驗證。慢性ACR中毒患者的主要臨床表現(xiàn)為:手掌多汗蛻皮、四肢麻木、跟腱反射減弱或消失等。在電鏡下腫脹的軸突末端微管(microtubules,MT)數(shù)量異常,但ACR導(dǎo)致MT損傷的機(jī)制不清楚。微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)中最豐富的是MAP2,MAP2最主要的功能是參與調(diào)節(jié)MT的組裝過程。鈣蛋白酶(Calpain)是一類依賴于Ca2+激活的中性半胱氨酸水解酶,它具有水解信號酶、細(xì)胞骨架蛋白(MAP2和Tau)和膜蛋白的功能,并且與神經(jīng)病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Calpeptin(CP)作為一種人工合成的肽類Calpain抑制劑,具有高效性、特異性及細(xì)胞滲透性好等優(yōu)點,與Calpain的活力位點結(jié)合,可逆的抑制Calpain的活力。假設(shè)由ACR誘導(dǎo)的MT損傷與calpain活力升高,MAP2降解有關(guān)。目的為了驗證ACR誘導(dǎo)的MT損傷與calpain活力升高和MAP2降解有關(guān)這個假設(shè),探索CP對ACR中毒大鼠MT損傷的干預(yù)作用及機(jī)制,為ACR中毒的預(yù)防與治療提供依據(jù)。方法1.動物處理:適應(yīng)性飼養(yǎng)后將Wistar大鼠隨機(jī)分為4組(每組10只),分別記為對照組、CP組、ACR組、ACR+CP組。對照組的大鼠腹腔注射(intraperitoneal,i.p.)給予生理鹽水;CP組的大鼠給予CP2000μg/kg(i.p.);ACR和ACR+CP組的大鼠給予ACR30 mg/kg(i.p.),給予ACR 1小時后,ACR+CP組給予CP200μg/kg(i.p.)。ACR隔天染毒,3次/周,共4周。CP隔天干預(yù),早晨和晚上各一次,6次/周,共4周。將ACR溶于0.9%的生理鹽水中(濃度為30mg/ml)并以1ml/kg給予大鼠。2.體重及神經(jīng)行為功能觀察:在染毒期間,每周測量體重、后肢撐力、加速轉(zhuǎn)棒試驗和步態(tài)評分。3.組織形態(tài)觀察:進(jìn)行HE染色以在光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓切片的形態(tài)變化。4.免疫組化法分析蛋白表達(dá):應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法在光學(xué)顯微鏡下觀察m-calpain、μ-calpain、MAP2、α-tubulin和β-tubulin蛋白在脊髓中的表達(dá)。5.免疫印跡法蛋白半定量:應(yīng)用凝膠電泳和半定量免疫印跡方法,對脊髓中m-calpain、μ-calpain、MAP2、α-tubulin和β-tubulin蛋白含量進(jìn)行半定量分析。6.統(tǒng)計方法:所有實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。步態(tài)評分的數(shù)據(jù)用Mann-Whitney U test分析,其它的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析,組間兩兩比較采用LSD法進(jìn)行分析。結(jié)果1.體重對照組與CP組4周之間基本相似不變;與對照組相比,自第2周開始,ACR組的大鼠體重下降了 5.6%(P0.05),隨著染毒的繼續(xù),這種趨勢更加明顯,到第4周時,ACR組的大鼠體重下降了 8.8%(P0.01);與ACR組相比,自第3周開始,ACR+CP組的大鼠體重增加了4.2%(P0.05),到第4周時,ACR+CP組的大鼠體重增加了6.2%(P0.01),且與對照組比較無顯著性差異(P0.05)。2.行為學(xué)指標(biāo)(1)后肢撐力:對照組與CP組4周之間基本相似不變;與對照組相比,自第2周開始,ACR組的大鼠后肢展寬增加了 26.9%(P0.01),隨著染毒的繼續(xù),這種趨勢更加明顯,到第4周時,ACR組的大鼠后肢展寬增加了34.4%(P0.01);與ACR組相比,自第3周開始,ACR+CP組的大鼠后肢展寬降低了15.9%(P0.01),到第4周時,ACR+CP組的大鼠后肢展寬降低了 16.3%(P0.01),且與對照組比較仍有顯著性差異(p0.05)。(2)加速轉(zhuǎn)棒試驗:對照組與CP組4周之間基本相似不變。與對照組相比,自第3周開始,ACR組的大鼠潛伏期下降了27.0%(P0.01),隨著染毒的繼續(xù),這種趨勢更加明顯,到第4周時,ACR組的大鼠潛伏期下降了 61.7%(P0.01);與ACR組相比,自第3周開始,ACR+CP組的大鼠潛伏期增加了20.2%(P0.01),到第4周時,ACR+CP組的大鼠潛伏期增加了 70.7%(P0.01),且與對照組比較仍有顯著性差異(P0.05)。(3)步態(tài)評分:對照組與CP組4周之間基本相似不變。與對照組相比,自第2周開始,ACR組的大鼠步態(tài)評分增加了 40%(P0.05),隨著染毒的繼續(xù),這種趨勢更加明顯,到第4周時,ACR組的大鼠步態(tài)評分增加了 150%(P0.01);與ACR組相比,自第3周開始,ACR+CP組的大鼠步態(tài)評分降低了35%(P0.05),到第4周時,ACR+CP組的大鼠步態(tài)評分降低了32%(P0.05),且與對照組比較仍有顯著性差異(P0.05)。3.組織病理在染毒終點,對照組和CP組大鼠的脊髓組織形態(tài)正常,組織結(jié)構(gòu)完整;運動神經(jīng)元的細(xì)胞核主要位于細(xì)胞中央,核仁清晰。但是ACR組脊髓組織排列疏松,囊泡狀改變;運動神經(jīng)元數(shù)目減少,部分細(xì)胞核固縮,核仁溶解甚至消失。與ACR組相比較,ACR+CP組的運動神經(jīng)元形態(tài)趨于正常,數(shù)量略有增加,但仍沒有恢復(fù)到對照組的正常水平。4.免疫組織化學(xué)與對照組相比,μ-calpain在ACR組和ACR+CP組表達(dá)無明顯差異。與對照組相比,m-calpain在ACR組過度表達(dá),與ACR組相比,ACR+CP組中m-calpain的表達(dá)降低。與對照組相比,MAP2在ACR組表達(dá)減少,與ACR組相比,ACR+CP組中MAP2的表達(dá)增加。與對照組相比,α-tubulin在ACR組和ACR+CP組表達(dá)無明顯差異。與對照組相比,β-tubulin在ACR組過度表達(dá),與ACR組相比,ACR+CP組中β-tubulin的表達(dá)減少。5.免疫印跡法蛋白半定量(1)Calpain與對照組相比,CP組、ACR組和ACR+CP組U-calpain含量的變化差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,CP組m-calpain含量的變化差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),ACR組的m-calpain含量增加了41.7%(P0.01),ACR+CP組的m-calpain含量增加了 14.6%(P0.05);然而與ACR組相比,ACR+CP組的m-calpain含量降低了 19.1%(P0.01)。(2)MAP2與對照組相比,CP組MAP2含量的變化差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),ACR組MAP2的含量下降了43.4%(P0.01)。然而與ACR組相比,ACR+CP組的MAP2含量上升了 67.5%(P0.01)。(3)MT與對照組相比,CP組、ACR組和ACR+CP組α-tubulin含量的變化差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與對照組相比,CP組β-tubulin含量的變化差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),ACR組β-tubulin的含量增加23%(P0.01);與ACR組相比,ACR+CP組β-tubulin的含量降低13.1%(P0.05)。結(jié)論1.ACR誘導(dǎo)的MT損傷與calpain活力升高和MAP2降解有關(guān),這可能是ACR誘導(dǎo)的MT損傷的機(jī)制之一。2.CP通過改變calpain和MAP2干預(yù)由ACR引起的MT損傷。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：
呈角狀膨大，稱前角，前角內(nèi)含有大量運動神經(jīng)元的細(xì)胞體，其軸突貫穿白質(zhì)，??經(jīng)前外側(cè)溝走出脊髓，組成脊神經(jīng)的前根，直接支配骨骼肌的運動。脊髓的白質(zhì)??主要由感覺和運動有髓鞘神經(jīng)纖維組成（縱行排列），詳見圖３－１。脊髓損傷主要??表現(xiàn)為運動障礙、感覺障礙及自主神經(jīng)功能障礙等。ＡＣＲ誘導(dǎo)的神經(jīng)病變在大??鼠模型中主要體現(xiàn)其對大鼠的運動功能損傷。為了與后肢撐力、加速轉(zhuǎn)棒試驗和??步態(tài)評分行為學(xué)指標(biāo)一致，在本次研宄中我們主要觀察ＡＣＲ對脊髓前角運動神??經(jīng)元形態(tài)的影響。??４６??
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本文編號：
2880695
