發(fā)布時(shí)間：2018-07-16 23:45

【摘要】：鉛是常見的環(huán)境重金屬污染物，具有顯著的神經(jīng)毒性。近年來研究證實(shí)：鉛在某些神經(jīng)退行性疾病（如PD、AD等）的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激、擾亂神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及其受體的表達(dá)和功能、擾亂細(xì)胞能量代謝等有關(guān)。因此深入研究鉛暴露產(chǎn)生的神經(jīng)毒性，闡明其作用機(jī)制，探討可能的防治措施，是預(yù)防醫(yī)學(xué)亟待解決的重大課題。 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)是鉛神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一。但是鉛離子本身并不具有強(qiáng)氧化性，因此我們推測鉛所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是一種間接作用。銅是人體必需的微量元素，但是，細(xì)胞中過量的銅可以導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)，從而在多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要的促進(jìn)作用。血腦脊液屏障（Blood-cerebrospinal fluid barrier, BCB）分隔血液和腦脊液，限制其間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，對維持大腦中銅的內(nèi)環(huán)境平衡也起到關(guān)鍵作用。以往研究表明，鉛暴露可以改變大腦銅離子內(nèi)環(huán)境平衡，引起神經(jīng)細(xì)胞銅的蓄積。細(xì)胞銅的代謝主要由銅轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控，包括銅轉(zhuǎn)運(yùn)體1（copper transporter1, CTR1）、二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1（divalent metaltransporter1, DMT1）、抗氧化蛋白1（antioxidant1copper chaperone, ATOX1）和銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶（如ATP7A、ATP7B）等，上述銅轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者就銅離子內(nèi)環(huán)境失衡所致毒性效應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但其確切的機(jī)制仍不十分明確。 綜上所述，我們推測鉛暴露可能通過改變這些銅轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，擾亂中樞神經(jīng)系統(tǒng)中銅的內(nèi)環(huán)境平衡。本研究以SD大鼠和大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞系Z310為實(shí)驗(yàn)對象，探討CTR1、ATP7A等銅轉(zhuǎn)運(yùn)體在鉛誘導(dǎo)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞銅蓄積中的作用，以及銅失衡在鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。本研究將為闡明鉛暴露導(dǎo)致大腦銅離子代謝紊亂及氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。 目的： 本研究通過建立慢性鉛暴露大鼠模型和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞系Z310模型，研究鉛暴露改變BCB中銅內(nèi)環(huán)境平衡的機(jī)制，探討CTR1、ATP7A等銅轉(zhuǎn)運(yùn)體在鉛誘導(dǎo)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞銅蓄積中的作用，以及銅失衡在鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。本研究將為闡明鉛暴露導(dǎo)致大腦銅離子代謝紊亂及氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。 方法： 1.建立動(dòng)物模型和細(xì)胞模型 1)動(dòng)物模型：將21日齡SD大鼠隨機(jī)分為室溫對照組（16只）和鉛暴露組（16只），參考前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道確定染毒劑量為100ppm Pb(AC)2；染毒方法為飲水法。 2)細(xì)胞模型：大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞系Z310，MTT法篩選鉛染毒劑量，根據(jù)結(jié)果我們在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇0、2.5、5、10μmol/L作為鉛暴露的濃度。 2.采用原子吸收分光光度法檢測鉛暴露大鼠血液、腦脊液、大腦組織中鉛、銅的含量；采用放射性同位素吸收實(shí)驗(yàn)Gamma計(jì)數(shù)法檢測鉛暴露對Z310細(xì)胞銅吸收的影響。 3.采用總SOD活性檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒，檢測鉛對細(xì)胞SOD活性和MDA含量的影響。 4.采用免疫熒光染色法檢測脈絡(luò)叢組織中CTR1、ATP7A的表達(dá)水平；用Westernblot、qRT-PCR等方法檢測鉛暴露對細(xì)胞CTR1、ATP7A等銅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平的影響。 5.采用siRNA干涉技術(shù)和抑制劑對細(xì)胞進(jìn)行處理，分別過表達(dá)和阻斷銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，觀察對細(xì)胞內(nèi)銅蓄積量的影響。 6.采用已構(gòu)建的Tet-可誘導(dǎo)CTR1高表達(dá)細(xì)胞系（iZCTR1），檢測細(xì)胞內(nèi)銅水平升高對細(xì)胞中銅轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP7A表達(dá)水平的影響。 結(jié)果： 1.慢性鉛暴露對大鼠大腦中銅含量和氧化應(yīng)激水平的影響鉛暴露后，與對照組相比，大鼠大腦（海馬、皮質(zhì)、紋狀體、腦脊液）中銅含量顯著升高（p0.01），并且大鼠大腦中氧化應(yīng)激水平增高，表現(xiàn)為T-SOD活力顯著下降，MDA含量顯著增高（p0.01）。 2.慢性鉛暴露對脈絡(luò)叢中銅轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響脈絡(luò)叢免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTR1的熒光表達(dá)量顯著增多，而ATP7A的表達(dá)量是顯著下降的。 3.鉛暴露導(dǎo)致Z310細(xì)胞內(nèi)銅蓄積與對照組相比，Z310細(xì)胞鉛處理24h后，細(xì)胞內(nèi)的銅吸收量顯著增加；細(xì)胞銅吸收后，再加入鉛處理24h，鉛處理組細(xì)胞中銅的水平顯著高于對照組（p0.01）。 4.鉛、銅暴露對Z310細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響單獨(dú)鉛暴露（5μmol/L Pb(AC)2）和銅暴露（5μmol/L CuCl2）24h均引起T-SOD的活力下降，鉛、銅聯(lián)合處理組T-SOD活力下降的幅度均顯著大于鉛或銅單獨(dú)暴露組（p0.01）；單獨(dú)鉛暴露和銅暴露24h均引起MDA含量增高；鉛、銅聯(lián)合處理組MDA含量增加的幅度均顯著大于鉛或銅單獨(dú)暴露組（p0.01）。 5.銅轉(zhuǎn)運(yùn)體在鉛暴露所致銅蓄積中的作用與對照相比，鉛暴露后，， CTR1的表達(dá)水平增高，ATP7A的表達(dá)水平下降，并具有劑量依賴性。CTR1siRNA干涉可以顯著抑制Z310細(xì)胞對銅的吸收，并且阻斷了鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞銅吸收增加；ATP7AsiRNA干涉可以顯著抑制Z310細(xì)胞對銅的排出（p0.01）。 6.細(xì)胞內(nèi)銅含量對銅轉(zhuǎn)運(yùn)體的反饋調(diào)節(jié)Z310細(xì)胞不同濃度（5，25和50μmol/L CuCl2）銅暴露24h后，細(xì)胞內(nèi)銅水平增高，CTR1的蛋白水平有明顯下降，而mRNA水平?jīng)]有明顯改變；ATP7A的蛋白水平和mRNA水平都沒有明顯變化。在iZCTR1細(xì)胞中，銅處理的細(xì)胞內(nèi)銅蓄積對ATP7A的表達(dá)水平并未產(chǎn)生顯著影響，而鉛處理可導(dǎo)致細(xì)胞中 ATP7A的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著降低（p0.01）。結(jié)論： 1.鉛暴露可導(dǎo)致動(dòng)物大腦組織和Z310細(xì)胞中銅水平的增高，而銅離子平衡的紊亂可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)。 2.鉛暴露導(dǎo)致的細(xì)胞中銅蓄積可能是通過兩種途徑：一是鉛暴露上調(diào)CTR1表達(dá)，吸收更多的銅進(jìn)入細(xì)胞；二是鉛暴露下調(diào)ATP7A表達(dá)，抑制了銅的運(yùn)輸功能，引起細(xì)胞中銅流出的減少。 3.細(xì)胞內(nèi)銅水平的增加對CTR1的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)反饋，對ATP7A的表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響。
[Abstract]:Lead is a common heavy metal pollutant in the environment , and has remarkable neurotoxicity . In recent years , it has been proved that lead plays an important role in the development of some neurodegenerative diseases ( such as PD , AD , etc . ) . Its mechanism may be related to inducing cell oxidative stress , disturbing neurotransmitter release and its receptor expression and function , disrupting cell energy metabolism , etc .

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本文編號：2128091