發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 08:36

　　 研究背景視網(wǎng)膜退行性疾病(Retinal degeneration,RD)指包括視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis pigmentosa,RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)和青光眼等在內(nèi)的一系列致盲性眼病。目前,RD是世界范圍內(nèi)不可逆盲的首位病因,也是WHO現(xiàn)階段防盲重點(diǎn)~([1]),其共同病理生理機(jī)制是感光細(xì)胞和(或)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cells,RGC)等神經(jīng)細(xì)胞漸進(jìn)性凋亡以及由此導(dǎo)致的視網(wǎng)膜感光功能喪失和視覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)障礙。由于致病因素的復(fù)雜性,此類(lèi)疾病目前尚缺乏有效治療手段。不同的致病因素,如遺傳突變或視網(wǎng)膜缺血、缺氧等損傷應(yīng)激,是否能夠觸發(fā)相同的細(xì)胞凋亡途徑?我們是否能夠調(diào)控該凋亡途徑?這對(duì)于治愈此類(lèi)病因異質(zhì)但表型相似的疾病是至關(guān)重要的。研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中感光細(xì)胞和RGC的進(jìn)行性凋亡主要?dú)w因于兩方面:其一是感光細(xì)胞或RGC因其自身基因突變?nèi)毕莅l(fā)生凋亡反應(yīng)~([2,3,4])。既往研究表明,鈣調(diào)蛋白酶(calpains)在視網(wǎng)膜細(xì)胞因基因缺陷合成并積累異常蛋白質(zhì)時(shí)被激活~([5]),且在退行性病變視網(wǎng)膜中依賴(lài)于calpains的細(xì)胞凋亡途徑具有重要地位~([6]);其二是視網(wǎng)膜退行性疾病中失衡的視網(wǎng)膜微環(huán)境加劇了感光細(xì)胞和RGC的非細(xì)胞自主性的凋亡~([7])。如在青光眼、DR和RP的視網(wǎng)膜中過(guò)量谷氨酸致calpains激活并參與細(xì)胞凋亡~([8])。此外,小膠質(zhì)細(xì)胞作為視網(wǎng)膜最主要的常駐免疫應(yīng)答細(xì)胞,其在退行性病變過(guò)程中被激活并扮演雙刃劍的角色。一方面,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以吞噬凋亡的細(xì)胞,清除炎癥物質(zhì),限制炎癥反應(yīng)。另一方面,過(guò)度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞則會(huì)釋放大量促炎因子惡化視網(wǎng)膜微環(huán)境~([9,10]),加劇感光細(xì)胞和RGC的凋亡。因此,抑制視網(wǎng)膜中依賴(lài)calpains的凋亡反應(yīng)或調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥可望成為治療視網(wǎng)膜退行性疾病的新策略。特異性促消退介質(zhì)(Specialized pro-resolving mediators,SPM)是機(jī)體內(nèi)ω-6/3多不飽和脂肪酸(ω-6/3 PUFA)代謝生成的一類(lèi)具有抗炎、促炎癥消退及促細(xì)胞再生的脂類(lèi)介質(zhì)~([11])。機(jī)體內(nèi)含量最為豐富的ω-6和ω-3 PUFA分別是花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)。在15-脂氧合酶(15-LOX)的作用下,DHA和AA分別代謝生成脂氧素A4(Lipoxin A4,LXA4)和神經(jīng)保護(hù)素D1(Neuroprotectin D1,NPD1)。前者主要表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎作用,而后者則具有較為顯著的神經(jīng)保護(hù)特性。既往文獻(xiàn)表明機(jī)體內(nèi)SPM的代謝失調(diào)在阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)、AMD以及青光眼等神經(jīng)退行性疾病中均可發(fā)生~([12,13,14]),且15-LOX參與介導(dǎo)DR中視網(wǎng)膜炎癥和青光眼中RGC的保護(hù)作用~([15,16])。這提示SPM可能是治療視網(wǎng)膜退行性疾病的重要調(diào)控介質(zhì)。因此,我們提出假設(shè):在視網(wǎng)膜退行性疾病的進(jìn)展中,SPM可能具有重要調(diào)控作用。SPM一方面通過(guò)直接抑制神經(jīng)細(xì)胞中calpains參與的凋亡反應(yīng)保護(hù)感光細(xì)胞、RGC等神經(jīng)細(xì)胞;另一方面,SPM通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,改善視網(wǎng)膜炎癥微環(huán)境來(lái)發(fā)揮間接神經(jīng)保護(hù)作用。研究目的本研究主要探索了LXA4和NPD1兩種重要的SPM對(duì)于視網(wǎng)膜退行性疾病過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是否具有調(diào)控作用。研究方法第一部分:LXA4延緩視網(wǎng)膜變性疾病的進(jìn)展1.按照RD1小鼠發(fā)育與其視網(wǎng)膜變性不同階段的關(guān)系,將RD1小鼠的病程分為變性前期(PN7)、變性高峰期(PN14)和變性晚期(PN21)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)對(duì)三階段的RD1小鼠視網(wǎng)膜中LXA4受體及其代謝關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估;2.分別于PN6、PN9和PN12行RD1小鼠玻璃體腔注射LXA4或PBS處理,而后進(jìn)行:1)運(yùn)用ERG、視覺(jué)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估RD1小鼠視功能;2)利用視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光染色技術(shù)評(píng)估RD1小鼠感光細(xì)胞的凋亡,RT-PCR及Western blotting從分子水平上檢測(cè)感光細(xì)胞特異標(biāo)記物Rhodopsin的表達(dá)水平;3)利用視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光、RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)RD1小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及其相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平;3.取PN13的RD1小鼠視網(wǎng)膜離體培養(yǎng)并進(jìn)行LXA4處理,于PN21應(yīng)用炎癥因子蛋白芯片檢測(cè)變性期間小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎癥因子及其激活標(biāo)記物CCL-2的表達(dá)水平變化。第二部分:NPD1保護(hù)NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型的RGC為了研究視網(wǎng)膜內(nèi)calpains參與的細(xì)胞凋亡反應(yīng),我們采用NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型。首先,為了明確NPD1對(duì)NMDA損傷RGC是否具有保護(hù)作用,我們進(jìn)行了:1.取出生后21天(PN21)的Long Evans(LE)大鼠隨機(jī)分組后行玻璃體腔注射N(xiāo)MDA、NMDA+NPD1、PBS,并在其后進(jìn)行視覺(jué)電生理檢查、視覺(jué)行為學(xué)檢查評(píng)估大鼠視功能,以及視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光染色評(píng)估RGC凋亡;2.取PN21的LE大鼠隨機(jī)分組后,分別以富含DHA飼料、缺乏DHA飼料和普通飼料喂養(yǎng)一個(gè)月,后行ELISA檢測(cè)內(nèi)源性NPD1水平是否增高。隨后大鼠接受玻璃體腔NMDA單獨(dú)注射或NMDA+NPD1共注射處理,并利用視覺(jué)電生理檢查、視覺(jué)行為學(xué)檢查評(píng)估大鼠視功能,以及免疫熒光染色評(píng)估RGC凋亡;接下來(lái),為了探究NPD1對(duì)NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型RGC保護(hù)作用的機(jī)制,我們進(jìn)行了:3.應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白組檢測(cè)技術(shù)分析玻璃體腔NMDA單獨(dú)注射或NMDA+NPD1共注射處理的LE大鼠視網(wǎng)膜中總RNA表達(dá)譜和蛋白質(zhì)的變化,并用RT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;4.取PN21的LE大鼠隨機(jī)分組后行玻璃體腔注射calpain 1、calpain 1+NPD1、PBS,并在其后進(jìn)行視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光染色評(píng)估RGC凋亡;RT-PCR檢測(cè)三組視網(wǎng)膜中Brn3a、Thy-1和RBPMs等RGC特異表達(dá)基因以及Bax、Bid、AIF等參與calpain 1依賴(lài)性凋亡途徑的基因的表達(dá)水平;5.采用視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光標(biāo)記iba1評(píng)估玻璃體腔NMDA單獨(dú)注射或NMDA+NPD1共注射處理的LE大鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),并利用Western blotting檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞激活及吞噬功能相關(guān)的生物標(biāo)記物CCL-2和ED-1蛋白的表達(dá)變化;RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組視網(wǎng)膜組織中炎癥因子表達(dá)變化。研究結(jié)果第一部分:LXA4延緩視網(wǎng)膜變性疾病的進(jìn)展1.LXA4維持RD1小鼠視功能作用的研究(1)LXA4合成限速酶和受體在視網(wǎng)膜變性過(guò)程中表達(dá)水平的變化在PN14的RD1小鼠視網(wǎng)膜中,Alox15和Fpr2 mRNA水平較PN7顯著升高(p0.0001),但與PN14相比,在RD1小鼠變性晚期(PN21)時(shí)兩者的表達(dá)顯著降低(p0.0001)。(2)LXA4延緩RD1小鼠視功能的喪失LXA4處理組RD1小鼠在PN15、PN18(p0.01)和PN21(p0.05)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ERG反應(yīng)中持續(xù)表現(xiàn)出比PBS處理組小鼠更高的b波幅值。在開(kāi)放明場(chǎng)視覺(jué)行為學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,PN18(p0.05)和PN21(p0.01)的LXA4處理組RD1小鼠在暗室中停留的時(shí)間明顯長(zhǎng)于PBS處理組,提示LXA4維持變性晚期RD1小鼠的視功能。2.LXA4對(duì)RD1小鼠視功能維持作用的機(jī)制研究(1)LXA4減少RD1小鼠視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞的凋亡免疫染色結(jié)果可見(jiàn)LXA4處理組RD1小鼠視網(wǎng)膜ONL的Rhodopsin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于PBS處理組。RT-PCR(p0.01)及Western blotting結(jié)果(p0.001)證實(shí)了LXA4處理的RD1小鼠視網(wǎng)膜中Rhodopsin表達(dá)水平更高。TUNEL染色顯示LXA4顯著減少感光細(xì)胞凋亡(p0.05)并維持RD1小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度(p0.01)。(2)LXA4緩解RD1小鼠視網(wǎng)膜中的小膠質(zhì)細(xì)胞激活1)LXA4緩解RD1小鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)LXA4處理使PN21的RD1小鼠視網(wǎng)膜中Alox5 mRNA表達(dá)水平顯著降低(p0.05)。2)LXA4調(diào)節(jié)RD1小鼠視網(wǎng)膜中激活小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥因子的表達(dá)免疫染色結(jié)果可見(jiàn)LXA4處理組與PBS處理組的變性晚期RD1小鼠視網(wǎng)膜中iba1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞皆呈現(xiàn)“阿米巴”樣激活狀態(tài),但Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),LXA4處理的RD1小鼠視網(wǎng)膜中iba1蛋白的表達(dá)水平較PBS處理組明顯降低(p0.01)。LXA4顯著抑制RD1小鼠視網(wǎng)膜中細(xì)胞因子,如CCL-2,iNOS,TNF-α,IFN-γ,IL-1β和GM-CSF在mRNA水平的表達(dá)(p0.05),但提高了IL10 mRNA水平表達(dá)(p0.0001)。以上數(shù)據(jù)提示LXA4減少RD1小鼠視網(wǎng)膜中激活小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,同時(shí)降低激活小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的促炎因子的表達(dá)。3)LXA4減少離體培養(yǎng)的RD1小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活細(xì)胞因子蛋白芯片結(jié)果顯示,LXA4處理組RD1小鼠視網(wǎng)膜及其培養(yǎng)上清中的所有可檢測(cè)到的炎癥因子與PBS處理組相比均顯著降低。PN21的RD1小鼠視網(wǎng)膜及其培養(yǎng)上清中都檢測(cè)到更高的CCL-2含量,且LXA4處理明顯降低了PN21的RD1小鼠視網(wǎng)膜CCL-2的產(chǎn)生和分泌(p0.05),提示LXA4降低變性晚期的RD1小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。第二部分:NPD1保護(hù)NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型的RGC1.NPD1保護(hù)NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型RGC的作用研究(1)大鼠玻璃體腔注射N(xiāo)PD1保護(hù)NMDA損傷的RGC1)大鼠玻璃體腔注射N(xiāo)PD1減少NMDA誘導(dǎo)的RGC凋亡大鼠玻璃體腔單獨(dú)注射N(xiāo)MDA后RGC發(fā)生劇烈快速的凋亡反應(yīng),且這種現(xiàn)象在72h內(nèi)較為明顯。利用LE大鼠行玻璃體腔NMDA單獨(dú)注射,或玻璃體腔NMDA+NPD1共注射,并在其后的24h、48h及72h時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NMDA單獨(dú)注射組相比,NMDA+NPD1共注射組的大鼠視網(wǎng)膜中TUNEL和Brn3a雙陽(yáng)性細(xì)胞分別由60±4.8%降至41±6.3%(p0.05),55±7.5%降至31±4.3%(p0.01),以及50±3.7%降至27±3.1%(p0.001),提示NPD1降低NMDA誘導(dǎo)的RGC凋亡反應(yīng)。2)大鼠玻璃體腔注射N(xiāo)PD1維持NMDA損傷的RGC電生理功能利用LE大鼠行玻璃體腔注射N(xiāo)MDA單獨(dú)注射,或NMDA+NPD1共注射,并在其后的72h內(nèi)行大鼠視覺(jué)電生理檢查。ERG結(jié)果發(fā)現(xiàn),NMDA+NPD1共注射組的大鼠的PhNR幅值從102±11μV以較平緩趨勢(shì)下降至63±13μV,而NMDA單獨(dú)注射組大鼠的PhNR幅值從103±14μV急劇下降至24±8μV。fVEP結(jié)果顯示,NMDA+NPD1共注射較NMDA單獨(dú)注射組的大鼠在24h、48h和72h皆維持較高的P_2波幅值(p0.05)。以上數(shù)據(jù)提示,NPD1維持NMDA損傷的RGC電生理功能。3)玻璃體腔注射N(xiāo)PD1挽救NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型的視敏度與PBS處理組相比,大鼠玻璃體腔單獨(dú)注射N(xiāo)MDA 72h后,其視敏度由0.76±0.05c/d下降至0.27±0.19 c/d,但NMDA+NPD1共注射組大鼠的視敏度僅下降至0.56±0.05c/d,顯著地挽救了大鼠的視功能(p0.001)。(2)內(nèi)源性提高NPD1保護(hù)NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型的RGC1)膳食補(bǔ)充DHA提高大鼠內(nèi)源性NPD1含量ELISA結(jié)果顯示,與膳食缺乏DHA組大鼠相比,大鼠膳食補(bǔ)充DHA可將其視網(wǎng)膜組織中內(nèi)源性NPD1含量由36.2±2.8提升至48.8±0.9 pg/mg(p0.001),血漿中NPD1含量則由6.0±0.03增至8.5±0.3 pg/ml(p0.001)。2)內(nèi)源性提高NPD1減少NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型的RGC凋亡免疫染色顯示,膳食缺乏DHA組大鼠行玻璃體腔注射N(xiāo)MDA損傷視網(wǎng)膜后,TUNEL和Brn3a雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占GCL的89.93±2.73%,而膳食富含DHA組大鼠行玻璃體腔注射N(xiāo)MDA損傷視網(wǎng)膜后,TUNEL和Brn3a雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)僅為21.33±2.36%(p0.001)。但膳食缺乏DHA組大鼠行玻璃體腔NMDA+NPD1共注射后,其雙陽(yáng)性細(xì)胞比例又可顯著降低至11.58±3.13%(p0.001),提示膳食缺乏DHA使RGC更容易受到NMDA誘導(dǎo)的損傷,但內(nèi)源性和外源性NPD1的升高都能減少RGC的凋亡。膳食富含DHA組大鼠行玻璃體腔注射N(xiāo)MDA損傷視網(wǎng)膜后,其PhNR幅值為44.23±4.66μV,而膳食缺乏DHA組大鼠在玻璃體腔注射N(xiāo)MDA損傷視網(wǎng)膜后,其PhNR幅值為22.78±1.93μV,較富含DHA組明顯降低(p0.05)。但膳食缺乏DHA組大鼠行玻璃體腔NMDA+NPD1共注射后,其PhNR幅值則被顯著維持在43.40±2.82μV(p0.05),提示膳食缺乏DHA使RGC更容易受到NMDA的損傷,但內(nèi)源性和外源性NPD1的升高都能維持RGC的功能。2.NPD1對(duì)NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型RGC保護(hù)作用的機(jī)制研究(1)NPD1通過(guò)降低大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中calpain 1的表達(dá)減少RGC凋亡1)NPD1調(diào)控大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中神經(jīng)死亡相關(guān)通路利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白組檢測(cè)技術(shù)篩選出玻璃體腔NMDA+NPD1共注射組與NMDA單獨(dú)注射組的大鼠視網(wǎng)膜組織中差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì),經(jīng)功能聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)NPD1調(diào)控神經(jīng)元死亡和發(fā)育以及炎癥反應(yīng)等過(guò)程。2)NPD1負(fù)調(diào)節(jié)大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中細(xì)胞凋亡反應(yīng)由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出NMDA+NPD1共注射組與NMDA單獨(dú)注射組的大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜組織中差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析,發(fā)現(xiàn)NPD1下調(diào)與細(xì)胞凋亡反應(yīng)相關(guān)的基因,火山圖中calpain 1在281個(gè)下調(diào)差異基因中排名位居前列。3)NPD1降低大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中calpain 1的表達(dá)以緩解視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡反應(yīng)Western blotting及RT-PCR結(jié)果顯示大鼠玻璃體內(nèi)NMDA單獨(dú)注射誘導(dǎo)其視網(wǎng)膜組織中calpain 1的蛋白(p0.05)和mRNA水平(p0.001)升高,且Bax,Bid,AIF和Caspase 3四個(gè)參與calpain 1依賴(lài)性凋亡途徑的基因的mRNA水平皆顯著升高(p0.001)。但NMDA+NPD1共注射則能夠顯著抑制大鼠視網(wǎng)膜中calpain 1蛋白(p0.05)和mRNA表達(dá)(p0.01),以及Bax,Bid,AIF和Caspase 3的mRNA表達(dá),提示NPD1降低大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中calpain 1的表達(dá)以緩解視網(wǎng)膜中細(xì)胞凋亡反應(yīng)。4)NPD1減少大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中calpain 1誘導(dǎo)的RGC凋亡在NMDA損傷的大鼠視網(wǎng)膜中,免疫染色顯示calpain 1與NeuN/Brn3a共定位,提示calpain 1表達(dá)在RGC上。利用LE大鼠上行玻璃體腔注射時(shí),免疫染色發(fā)現(xiàn),與PBS處理組相比,calpain 1單獨(dú)注射組大鼠視網(wǎng)膜中凋亡的RGC由1.96±0.51%提高至19.08±1.58%(p0.001),但calpain 1+NPD1共注射組大鼠視網(wǎng)膜中RGC的凋亡僅為8.90±1.10%,明顯低于calpain 1單獨(dú)注射組(p0.001)。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),與calpain1單獨(dú)注射組相比,calpain 1+NPD1共注射組大鼠視網(wǎng)膜中Brn3a、Thy-1和RBPMs等RGC特異表達(dá)基因的mRNA水平較高,而B(niǎo)ax、Bid、AIF以及Caspase 3的mRNA水平較低。以上結(jié)果提示,NPD1減少calpain 1誘導(dǎo)的RGC凋亡。(2)NPD1通過(guò)調(diào)控大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)保護(hù)RGC1)NPD1調(diào)控大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜組織中炎癥相關(guān)通路由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白組檢測(cè)技術(shù)篩選出玻璃體腔NMDA+NPD1共注射組與NMDA單獨(dú)注射組大鼠視網(wǎng)膜組織中差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì),經(jīng)功能聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)NPD1參與調(diào)控大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng),差異基因熱圖提示NPD1下調(diào)炎癥反應(yīng)中的基因。2)NPD1降低大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中炎癥因子表達(dá)水平LE大鼠行玻璃體腔NMDA+NPD1共注射相較于NMDA單獨(dú)注射,可以顯著降低其視網(wǎng)膜中諸如CCL-2、IL1β、IFN-γ、TNFα等細(xì)胞因子的表達(dá),但又上調(diào)了抗炎因子TGF-β和IL10,皆具有差異顯著性(p0.001),提示NPD1降低大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中炎癥因子的表達(dá)。3)NPD1緩解大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥LE大鼠行玻璃體腔NMDA+NPD1共注射與NMDA單獨(dú)注射,由免疫染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者視網(wǎng)膜中iba1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)出更多分枝和更長(zhǎng)突起(p0.05),由Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者視網(wǎng)膜中CCL-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(p0.05),而ED-1蛋白的表達(dá)水平升高至后者視網(wǎng)膜組織的8.5倍(p0.05),提示NPD1降低大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,并促進(jìn)其吞噬清除作用,從而限制炎癥反應(yīng)。研究結(jié)論1.本研究揭示,在視網(wǎng)膜退行性疾病動(dòng)物模型RD1小鼠中,SPM的代謝關(guān)鍵酶15-LOX的表達(dá)水平在病變?cè)缙谙却鷥斝陨��?在病變晚期則顯著降低,表明內(nèi)源性SPM失調(diào)可發(fā)生在視網(wǎng)膜退行性疾病中。這為采用SPM調(diào)控視網(wǎng)膜退行性疾病進(jìn)展提供了新的思路。2.本研究發(fā)現(xiàn),LXA4和NPD1兩種SPM皆能調(diào)控RD1小鼠視網(wǎng)膜和大鼠NMDA損傷視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與功能來(lái)緩解其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),從而改善退行性病變視網(wǎng)膜的微環(huán)境,間接保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。3.本研究觀察到,LXA4和NPD1兩種SPM皆具有減少退行性病變視網(wǎng)膜中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。LXA4降低RD1小鼠變性晚期視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞的凋亡并維持外核層的厚度,挽救視網(wǎng)膜電生理功能。NPD1減少NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型的RGC的凋亡并維持其電生理反應(yīng)。4.本課題創(chuàng)新性地利用視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)技術(shù),在組織水平上離體研究了SPM對(duì)于退行性病變視網(wǎng)膜中炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用,并證實(shí)LXA4顯著降低RD1小鼠變性晚期視網(wǎng)膜中CCL-2的產(chǎn)生與分泌。這明確了LXA4對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制作用是其限制退行性病變視網(wǎng)膜炎癥的重要機(jī)制。5.本課題率先報(bào)道在NMDA損傷視網(wǎng)膜大鼠模型的視網(wǎng)膜中calpains參與的RGC凋亡途徑,并發(fā)現(xiàn)外源性NPD1通過(guò)降低NMDA損傷大鼠視網(wǎng)膜calpain 1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其對(duì)RGC的抗凋亡作用。這為延緩視網(wǎng)膜退行性疾病中進(jìn)行性的神經(jīng)細(xì)胞變性和凋亡提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R774.1
【部分圖文】：

圖 2-2 開(kāi)放明場(chǎng)實(shí)驗(yàn)示意圖（2）實(shí)驗(yàn)步驟：RD1小鼠暗適應(yīng)過(guò)夜；安裝開(kāi)放明場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備（圖2-2），確保白箱底部光強(qiáng)度為300lx；在暗適應(yīng)條件下，RD1小鼠先分別放入黑箱、白箱適應(yīng)2min后，將小鼠置于白箱底部正中。當(dāng)置于頂部的錄相機(jī)開(kāi)始記錄時(shí)，同時(shí)開(kāi)燈并打開(kāi)黑白箱中間的孔洞，記錄5min內(nèi)小鼠在黑、白箱之間往返的行為。在進(jìn)行下一只小鼠實(shí)驗(yàn)前，充分清潔黑白箱。最后統(tǒng)計(jì)各小鼠待在黑箱中的時(shí)間以評(píng)估其視功能。7. 視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛用于體外研究視網(wǎng)膜發(fā)育、神經(jīng)變性和神經(jīng)死亡等過(guò)程及探尋有效的神經(jīng)保護(hù)，細(xì)胞移植等治療策略[42]。將PN13的RD1小鼠的視網(wǎng)膜完整分離出，并置于transwell膜上培養(yǎng)于12孔板中。培養(yǎng)基為含有1% N2, 2% B27, 0.8 mML-Glutamine和1%青霉素/鏈霉素的Neurobasal神經(jīng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)過(guò)夜后

1. LXA4 維持 RD1 小鼠視功能作用的研究(1) LXA4 合成限速酶和受體在視網(wǎng)膜變性過(guò)程中表達(dá)水平的變化在研究 LXA4 對(duì)視網(wǎng)膜退行疾病進(jìn)展的影響作用之前，我們首先進(jìn)行 RT-PCR 評(píng)估RD1 小鼠視網(wǎng)膜組織中 Alox5，Alox15 和 Fpr2（分別為 5-LOX，15-LOX 和 ALX/FPR2的小鼠直系同源物）的表達(dá)水平變化。與變性前期（PN7）相比，在變性高峰期（PN14）時(shí)三種基因的 mRNA 表達(dá)水平皆上調(diào)，且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2-3）。然而，與PN14 相比，在變性晚期（PN21）RD1 小鼠視網(wǎng)膜中 Alox15 和 Fpr2 表達(dá)的顯著降低（p<0.0001）（圖 2-3B，C），其中 Fpr2 在 PN21 的表達(dá)低于 PN7 的表達(dá)（p <0.05）。而 PN21時(shí) RD1 小鼠視網(wǎng)膜的 Alox5 的 mRNA 水平卻持續(xù)升高，較 PN7 時(shí)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01）。鑒于 5-LOX 在炎癥介質(zhì)白三烯生物合成中的關(guān)鍵作用[43]，Alox5 的上調(diào)提示變性視網(wǎng)膜中炎癥反應(yīng)逐漸加重。以上數(shù)據(jù)提示，LXA4 合成限速酶和受體在視網(wǎng)膜變性期間先上調(diào)，而后在變性末期顯著降低。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究外源性 LXA4 對(duì)視網(wǎng)膜退行疾病進(jìn)展的影響奠定了基礎(chǔ)。

LXA4 處理使 RD1 小鼠維持較好的視覺(jué)行為小鼠在暗室活動(dòng)的時(shí)間統(tǒng)計(jì)(n=5)。結(jié)果采用雙數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，* p <0.05，** p 開(kāi)放明場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中 RD1 小鼠在暗室活動(dòng)的時(shí)（Sidak 多重比較, x±s, n=5, s）PN15 PN18 192.80 ±27.12 86.40 ±6.59 240.60 ±22.44 148.60 ±15.51 2.03 2.64 0.15 0.04 鼠視功能維持作用的機(jī)制研究1 小鼠視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞的凋亡
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本文編號(hào)：2892810