發(fā)布時間：2020-11-12 06:07

　　 背景移植排斥引起的慢性腎間質(zhì)纖維化一直是移植腎慢性功能喪失的主要原因,其主要病理改變表現(xiàn)為腎小管萎縮伴隨間質(zhì)纖維組織增生,主要特點是肌成纖維細胞活化分泌細胞外基質(zhì)。腎纖維化時有關(guān)肌成纖維細胞目前認為可能有多種來源,包括:腎內(nèi)固有成纖維細胞的激活、骨髓內(nèi)細胞的遷移來源、從腎小管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞以及血管周細胞的轉(zhuǎn)化而來。其中腎小管上皮細胞經(jīng)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)一直是移植慢性纖維化不可忽視的來源之一。腎移植急性排斥反應(yīng)組織學(xué)上雖形態(tài)多樣,其主要特征是炎細胞(免疫細胞)的浸潤,可表現(xiàn)為腎間質(zhì)炎、小管炎和動脈內(nèi)膜炎。相對于動脈內(nèi)膜炎,以腎間質(zhì)炎、小管炎為表現(xiàn)的急性腎排斥反應(yīng)更為常見,特別是小管炎病變輕重可直接反映急性排斥的嚴重程度。近年來急性排斥反應(yīng)浸潤的巨噬細胞與移植腎慢性纖維化形成可能的相關(guān)性開始逐漸引起人們的關(guān)注。曾有報道急性排斥反應(yīng)浸潤巨噬細胞越嚴重,其腎移植后1年、2年和4年移植腎功能狀態(tài)越差,提示巨噬細胞浸潤可能與移植腎慢性纖維化形成密切相關(guān)。我們前期研究顯示:激活的巨噬細胞與體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞NRK52E共培養(yǎng)后,可使培養(yǎng)的NRK52E出現(xiàn)明顯的上皮標記物表達降低、同時出現(xiàn)間充質(zhì)細胞標記物,即出現(xiàn)NRK52E的EMT;隨之質(zhì)譜分析顯示激活的巨噬細胞后分泌多種細胞因子包括:TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、IL-6(白細胞介素-6)、補體C3、Hsp90(熱休克蛋白90)、MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)、Osteopontin(骨橋蛋白)和TNF-α(腫瘤壞死因子-α)。TGF-β1作為公認纖維因子,可誘導(dǎo)腎小管細胞發(fā)生EMT,進而可能參與纖維化的形成。除了TGF-β1外,激活巨噬細胞分泌的其他因子是否也具有誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生EMT,進而參與腎纖維化進程尚不十分明確。本研究我們選擇細胞因子IL-6,觀察單獨的IL-6是否具有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)NRK52E發(fā)生表型轉(zhuǎn)化、進而發(fā)生EMT的能力。目的以大鼠腎小管上皮細胞株NRK52E為研究對象,檢測IL-6誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的NRK52E發(fā)生由上皮細胞表型向間充質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的能力。方法選擇:E-鈣粘蛋白(E-Cadherin,E-Ca)和細胞角蛋白-19(Cytokeratin,CK19)作為上皮細胞標記物,α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)作為間充質(zhì)細胞標記物。以終濃度分別為25ng/ml,50ng/ml和100ng/ml IL-6,在培養(yǎng)基DMEM中分別誘導(dǎo)培養(yǎng)NRK52E細胞24小時、48小時和72小時,同時以等體積IL-6溶解劑為對照組,先在倒置顯微鏡下觀察不同誘導(dǎo)時間對照組和各誘導(dǎo)組NRK52E細胞的形態(tài)學(xué)變化,再以Real-Time qPCR方法分別檢測各組細胞其上皮細胞標記物和間充質(zhì)細胞標記物mRNA表達。同樣以終濃度50ng/ml IL-6,誘導(dǎo)培養(yǎng)NRK52E細胞24小時、48小時和72小時,Western Blot方法檢測上皮細胞標記物和間充質(zhì)細胞標記物的蛋白表達。再以終濃度50ng/ml IL-6,誘導(dǎo)培養(yǎng)NRK52E細胞72小時,免疫細胞化學(xué)和免疫熒光染色進一步檢測和驗證上皮細胞標記物和間充質(zhì)細胞標記物蛋白表達。結(jié)果形態(tài)學(xué)觀察:體外培養(yǎng)的NRK52E對照組細胞在培養(yǎng)過程中始終保持貼壁生長,基本呈典型的鵝卵鋪路石樣,并且細胞間銜接緊密。而各誘導(dǎo)組細胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后,均可見細胞出現(xiàn)有短梭形樣,隨著IL-6濃度的升高,細胞梭形越明顯;繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)48和72小時后,各誘導(dǎo)組細胞見細胞長梭形愈加明顯,提示IL-6可以使體外培養(yǎng)的NRK52E細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,從典型的上皮細胞的鵝卵石樣形態(tài)變?yōu)槎趟笮魏退笮?而且隨著IL-6培養(yǎng)時間的延長、濃度的增加,細胞向梭形形態(tài)的改變越明顯。Real-Time qPCR結(jié)果:在不同濃度的IL-6誘導(dǎo)培養(yǎng)NRK52E細胞24小時和48小時后,各誘導(dǎo)組細胞上皮標記物CK19、E-Ca的mRNA表達與對照組相比無明顯差異,而間充質(zhì)細胞標記物α-SMA、vimentin mRNA表達在誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時后出現(xiàn)了短暫一過性的明顯低于對照組細胞,繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,各誘導(dǎo)組α-SMA、vimentin mRNA表達則迅速恢復(fù)到與對照組表達水平基本相一致,甚至出現(xiàn)了在IL-6濃度為50ng/ml誘導(dǎo)組細胞培養(yǎng)48小時后,α-SMA mRNA表達明顯高于對照組細胞。當繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時后,上皮標記物CK19、E-Ca的mRNA表達均明顯降低,同時間充質(zhì)標記物α-SMA、vimentin的mRNA表達則明顯升高且與對照組相比差異顯著,說明IL-6誘導(dǎo)培養(yǎng)NRK52E細胞72小時后,細胞出現(xiàn)了明顯的上皮細胞表型向間充質(zhì)細胞表型的改變或稱表型轉(zhuǎn)化。Western Blot結(jié)果:濃度為50ng/ml的IL-6體外誘導(dǎo)NRK52E,誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時和48小時后,其上皮細胞標記物CK19、E-Ca及間充質(zhì)標記物vimentin的蛋白表達與相應(yīng)的對照組相比未見有明顯變化,但α-SMA的蛋白表達則表現(xiàn)為在培養(yǎng)24小時后出現(xiàn)了一過性明顯低于相應(yīng)對照組細胞,但當繼續(xù)培養(yǎng)48小時后α-SMA的蛋白表達則迅速恢復(fù),并表現(xiàn)為其表達明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。當繼續(xù)培養(yǎng)72小時后,與對照組相比,誘導(dǎo)組細胞上皮CK19、E-Ca蛋白表達量均低于對照組,同時間充質(zhì)標記物α-SMA、vimentin的蛋白表達則明顯高于對照組,Western Blot蛋白表達結(jié)果與上述Real-time qPCR檢查結(jié)果相一致。免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,NRK52E細胞在50ng/ml濃度的IL-6體外誘導(dǎo)72h后,對照組細胞見有上皮標記物E-Ca明確強陽性染色、呈線性分布于細胞膜,同時其間充質(zhì)標記物vimentin則染色陰性。而誘導(dǎo)組細胞上皮標記物E-Ca的染色僅表現(xiàn)為弱陽性染色,同時間充質(zhì)標記物vimentin出現(xiàn)了明確的陽性染色。免疫熒光染色結(jié)果與免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果相一致,即IL-6誘導(dǎo)培養(yǎng)NRK52E72小時后,誘導(dǎo)組細胞上皮標記物E-Ca免疫熒光染色明顯減弱,同時出現(xiàn)了明顯的間充質(zhì)標記物vimentin明確陽性染色。免疫細胞化學(xué)和免疫熒光染色進一步驗證了IL-6誘導(dǎo)培養(yǎng)NRK52E細胞72小時后,細胞出現(xiàn)了明顯的細胞表型轉(zhuǎn)化�？傊�,從細胞形態(tài)、mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯示,IL-6可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的NRK52E細胞發(fā)生由上皮細胞表型向間充質(zhì)細胞表型的改變或稱表型轉(zhuǎn)化。結(jié)論IL-6可以成功的誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞株NRK52E細胞出現(xiàn)由上皮細胞表型向間充質(zhì)細胞表型的改變或稱表型轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R699.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 文獻綜述
        1.1.1 腎間質(zhì)纖維化
        1.1.2 腎小管上皮細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化
        1.1.3 慢性移植腎纖維化與巨噬細胞
    1.2 引言
第2章 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 其他試劑
    2.2 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 腎小管上皮細胞（NRK52E）的培養(yǎng)、傳代、凍存與復(fù)蘇
        2.3.2 IL-6 體外誘導(dǎo)NRK52E細胞
        2.3.3 倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的NRK52E細胞形態(tài)改變
        2.3.4 Real-Time qPCR檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的NRK52E細胞表型轉(zhuǎn)化
        2.3.5 Western Blot檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的NRK52E細胞表型轉(zhuǎn)化
        2.3.6 免疫細胞化學(xué)和免疫熒光檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的NRK52E細胞表型轉(zhuǎn)化
    2.4 統(tǒng)計學(xué)分析
第3章 實驗結(jié)果
    3.1 IL-6 誘導(dǎo)NRK52E細胞后的細胞形態(tài)學(xué)改變
    3.2 Real-Time qPCR檢測IL-6 誘導(dǎo)NRK52E細胞表型轉(zhuǎn)化
    3.3 Western Blot檢測IL-6 誘導(dǎo)NRK52E細胞表型轉(zhuǎn)化
    3.4 免疫細胞化學(xué)染色檢測IL-6 誘導(dǎo)NRK52E細胞表型轉(zhuǎn)化
    3.5 免疫熒光染色檢測IL-6 誘導(dǎo)NRK52E細胞表型轉(zhuǎn)化
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻
作者簡介
致謝

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 杜偉;活化的巨噬細胞誘導(dǎo)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化[D];吉林大學(xué);2015年

2 陳爽;TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化狀態(tài)研究[D];吉林大學(xué);2008年

本文編號：2880359