發(fā)布時間：2020-11-11 02:13

　　 目的:糖尿病腎病(DN)是一種嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥。腎臟活檢數(shù)據(jù)分析顯示,糖尿病患者腎臟損害包括上皮細(xì)胞和支持細(xì)胞功能障礙。足細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞,是腎小球重要的功能細(xì)胞,一旦損傷,不能再生。足細(xì)胞損傷和凋亡會導(dǎo)致腎小球濾過膜的功能障礙,并成為誘導(dǎo)DN發(fā)生的不利因素。CXCR3為趨化因子CXCL9/CXCL10/CXCL11的共同受體,與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。CXCR3分布于多種免疫細(xì)胞的表面,如自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell),類漿樣細(xì)胞(plasmacytoid cells)、樹突細(xì)胞(dendritic cell),特別是活化的T細(xì)胞。DN的發(fā)生與足細(xì)胞凋亡增加、增殖減少有關(guān),而足細(xì)胞凋亡與這些炎性細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子密切相關(guān)。因此,高糖環(huán)境下足細(xì)胞CXCR3表達(dá)及其與凋亡、炎癥反應(yīng)間的關(guān)系值得研究。為此,我們觀察了不同葡萄糖濃度下體外培養(yǎng)足細(xì)胞的增殖活性以及CXCR3在足細(xì)胞中的表達(dá)情況,研究CXCR3對體外培養(yǎng)足細(xì)胞凋亡的影響;進(jìn)一步探討了CXCR3對足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)以及足細(xì)胞足突間裂空隔膜(SD)組分蛋白podocin、nephrin的影響,探討CXCR3與活性氧(ROS)以及TNF-a、IL-6、IL-1β等炎癥因子表達(dá)的關(guān)系,明確CXCR3在DN發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:首先,體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞,待其分化成熟后分五組,分別在5.5mM、15mM、25mM、35mM、50mM葡萄糖濃度下培養(yǎng)。使用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活性,使用Quantitative real-time PCR(Q-rtPCR)檢測足細(xì)胞CXCR3mRNA、Western blots(WB)檢測CXCR3蛋白表達(dá)。其次,將體外培養(yǎng)分化成熟的足細(xì)胞分為四組:模型組(30Mm葡萄糖);干擾組(30Mm葡萄糖+CXCR3siRNA);空載體組(30Mm葡萄糖+空載體);正常對照組(5.5Mm葡萄糖),分別于12h、24h、48h、72h用CCK-8試劑盒測細(xì)胞活性,使用Q-rtPCR檢測CXCR3mRNA、WB檢測CXCR3蛋白表達(dá),應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率,使用JC-1熒光探針檢測線粒體跨膜電位(ΔΨM),使用二氯二乙酸酯(DCFH-DA)測量ROS含量,使用ELISA檢測TNF-a、IL-6、IL-1β含量,使用WB檢測podocin、nephrin、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白含量。結(jié)果:體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞的活性隨葡萄糖濃度的增加而降低,且呈劑量和時間依賴性;同時,CXCR3mRNA及CXCR3蛋白的表達(dá)隨葡萄糖濃度的增加而增加,且呈劑量和時間依賴性。模型組足細(xì)胞活性低于正常組,CXCR3mRNA及CXCR3蛋白含量高于正常組,線粒體跨膜電位ΔΨM低于正常組,細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組,細(xì)胞周期阻滯在S期及G2/M期;模型組足細(xì)胞ROS、TNF-a、IL-6、IL-1β含量明顯高于正常組;模型組足細(xì)胞SD組分蛋白podocin、nephrin顯著低于正常組,凋亡蛋白Bax、caspase-3高于正常組,抗凋亡蛋白Bcl-2低于正常組。CXCR3siRNA提高了高糖環(huán)境下足細(xì)胞的活性與ΔΨM,降低了細(xì)胞凋亡與ROS、TNF-a、IL-6、IL-1β水平,提高了podocin、nephrin、Bcl-2蛋白表達(dá),降低了Bax、Caspase-3表達(dá)。結(jié)論:高糖提高了小鼠足細(xì)胞CXCR3表達(dá),降低了足細(xì)胞增殖活性、引起細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡,提高了ROS及炎癥因子水平,降低了SD組分蛋白表達(dá);抑制CXCR3表達(dá)可增強(qiáng)足細(xì)胞增殖活性,減少細(xì)胞凋亡與ROS、炎癥因子水平,提高SD組分蛋白表達(dá)。CXCR3在足細(xì)胞凋亡中可能起重要作用,與誘導(dǎo)ROS與炎癥反應(yīng)有關(guān)�？梢�,CXCR3可能是DN的一個潛在治療靶點。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

1 足細(xì)胞在不同糖濃度下細(xì)胞活性的變化（Mean±SD,n=3）。圖中數(shù)據(jù)對于 5.5 mM 糖作用下的比值。2 不同濃度葡萄糖對足細(xì)胞 CXCR3 mRNA 表達(dá)的影響（Mean±SD,n=3與 5.5 mM 葡萄糖作用組相比，P<0.01。

不同濃度葡萄糖對足細(xì)胞CXCR3mRNA表達(dá)的影響（Mean±SD,n=3）.**與5.5mM葡萄糖作用組相比，P<0.01

圖 1.3 不同濃度葡萄糖對足細(xì)胞 CXCR3 蛋白表達(dá)的影響（Mean±SD,n=3）. ** 與5.5 mM 葡萄糖作用組相比，P<0.01。1.3 討論糖尿病腎�。―N），為終末期腎功能衰竭的主要原因之一，是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，1 型或 2 型糖尿病患者有 30%–40%可發(fā)展為 DN[2]。DN 的早期癥狀是尿蛋白增多，以腎小球系膜結(jié)節(jié)樣增生和腎小球基底膜增厚為特征。微量白蛋白尿在腎小球基底膜的變化中起重要作用。此外，詳細(xì)的腎臟活檢數(shù)據(jù)分析顯示糖尿病患者腎臟損害包括內(nèi)臟上皮細(xì)胞和支持細(xì)胞功能障礙[3, 4]。許多研究表明糖尿病腎病足細(xì)胞損傷是多因素共同導(dǎo)致的，包括機(jī)械應(yīng)力，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、TGF-β1 誘導(dǎo)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活，和 AGEs 的積累。并且有許多信號通路包含在由自噬介導(dǎo)的調(diào)節(jié) mTOR 信號通路，腺苷單磷酸激酶（AMPK）信號通路，Wnt 信號通路，β-catenin 信號通路等。該相關(guān)的機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。AMPK 不僅是一種在糖尿病進(jìn)
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本文編號：2878606