發(fā)布時(shí)間：2020-11-10 21:51

　　 研究目的:局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是與足細(xì)胞損傷相關(guān)的一種臨床病理綜合征。自從20世紀(jì)30年代初對(duì)這種臨床病理現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)以來,各種研究揭示了有關(guān)FSGS的可能潛在的發(fā)病機(jī)制,包括:由于足細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能固有的缺陷而引起的原發(fā)性FSGS;由體脂含量過高、病毒等外源物質(zhì)、藥物、循環(huán)因子等誘導(dǎo)的繼發(fā)性FSGS;某些單基因突變所造成的與遺傳因素相關(guān)的FSGS。然而FSGS的具體致病原因仍然是未知的,大量研究顯示與足細(xì)胞相關(guān)的單基因的變異參與了FSGS的發(fā)病過程。我們課題組分別探索了NPHS1,COL4A5,APOL1三種足細(xì)胞相關(guān)基因,從生物信息學(xué)分析、臨床個(gè)案報(bào)道以及對(duì)細(xì)胞形態(tài)和功能的影響等不同角度開展研究。期望檢測出與FSGS相關(guān)的變異,并初步探討其致病機(jī)制,以利于臨床診斷和預(yù)后。研究方法:(1)收集既往文獻(xiàn)中報(bào)道的關(guān)于NPHS1基因突變的信息,匯總后作為參考。從千人基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出包含2504名健康受試者的NPHS1突變信息作為正常對(duì)照。臨床收集309名散發(fā)型FSGS患者,運(yùn)用基于36種基因的Panel的二代測序和全外顯子組測序的方法,進(jìn)行NPHS1基因變異檢測。在患者中統(tǒng)計(jì)出錯(cuò)義突變位點(diǎn)后,分別用三種軟件進(jìn)行致病性的預(yù)測。分析測序和預(yù)測的結(jié)果并結(jié)合nephrin蛋白結(jié)構(gòu)繪制熱點(diǎn)功能域圖。(2)對(duì)1例有腎臟病家族史的腎活檢證實(shí)為FSGS的患者,進(jìn)行IV型膠原免疫組織化學(xué)染色,并提取外周血DNA進(jìn)行全外顯子測序,尋找可能的致病突變。(3)基于前期研究,構(gòu)建定點(diǎn)突變位點(diǎn)的APOL1質(zhì)粒,通過電穿孔方法將定點(diǎn)突變的質(zhì)粒和購買的野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)生長狀態(tài)良好的足細(xì)胞。48小時(shí)后在顯微鏡下觀察比較突變型質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響;利用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體方法將突變型和野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞,通過膜片鉗方法檢測其對(duì)細(xì)胞膜上氯離子通道的影響。研究結(jié)果:(1)在309名散發(fā)型FSGS患者中共找到17個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)和1個(gè)剪切突變位點(diǎn),其中有一個(gè)新的突變位點(diǎn)是在第19號(hào)外顯子中的c.G2638T,同時(shí)第28號(hào)外顯子中的35830957 CT剪接突變也是一個(gè)新的突變位點(diǎn)。通過軟件預(yù)測共發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變位點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致FSGS的發(fā)生。大部分錯(cuò)義突變位點(diǎn)集中在nephrin蛋白Ig1,Ig3,Ig7和C-末端細(xì)胞跨膜區(qū)域。(2)患者的腎臟組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,IV型膠原抗體染色結(jié)果COL4A5組表達(dá)低于正常對(duì)照組。全外顯子測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)COL4A5基因第20位氨基酸出現(xiàn)異常,顯示為移碼突變。綜合診斷該名患者確診為表現(xiàn)出FSGS激素敏感性的由COL4A5基因新突變所引起的Alport綜合征的病例(3)APOL1基因會(huì)使足細(xì)胞發(fā)生溶解和破裂現(xiàn)象,新發(fā)現(xiàn)的突變會(huì)造成足細(xì)胞大面積的形態(tài)異常,甚至導(dǎo)致成團(tuán)的聚集和死亡。同時(shí),該基因會(huì)上調(diào)細(xì)胞膜氯離子通道的電流值,隨著電壓的升高,突變組對(duì)氯離子流動(dòng)影響顯著。研究結(jié)論:我們分別從三個(gè)足細(xì)胞相關(guān)的熱點(diǎn)基因展開遺傳學(xué)研究,從不同層面探討基因突變對(duì)中國FSGS患者的影響。結(jié)果表明,NPHS1基因突變?cè)谖覈鳩SGS患者中較為常見,但我國FSGS遺傳背景與西方人有較大差異且存在多個(gè)突變位點(diǎn)與FSGS存在一定的相關(guān)性。新發(fā)現(xiàn)的COL4A5基因突變位點(diǎn)可能為Alport綜合征的致病性遺傳位點(diǎn),建議臨床將病理結(jié)果結(jié)合基因檢查報(bào)告對(duì)復(fù)雜的病例進(jìn)行綜合性診斷,提高診斷精準(zhǔn)度,避免不必要的激素用藥。在我國患者中發(fā)現(xiàn)的APOL1基因的新突變會(huì)造成足細(xì)胞形態(tài)的損傷并可能破壞細(xì)胞氯離子通道,從而導(dǎo)致FSGS的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

NPHsl基因錯(cuò)義突變?cè)诓煌�人群中的位點(diǎn)總結(jié)

是 Ig1 和跨膜結(jié)構(gòu)域分別出現(xiàn)兩個(gè)突變。這些突變區(qū)域與以往其他地區(qū)的報(bào)道顯示既有重合也有不同之處，提示 NPHS1 基因在我國散發(fā)型 FSGS 患者中的突變與其他地區(qū)的情況有所不同。2.2.3 中國 FSGS 患者突變位點(diǎn)所在功能域分析我們針對(duì)本研究中所發(fā)現(xiàn)的17個(gè)錯(cuò)義突變，結(jié)合NPHS1基因外顯子和nephrin蛋白功能域的對(duì)應(yīng)關(guān)系，繪制出突變熱點(diǎn)功能域圖。雖然總體來說 NPHS1 基因突變位點(diǎn)在 nephrin 蛋白結(jié)構(gòu)域中的分布情況仍然比較分散，這與我們前期總結(jié)出的突變結(jié)果相似，但是其中值得關(guān)注的是我們的研究結(jié)果顯示 Ig3 和 Ig7 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生致病性突變的概率相對(duì)集中且突變率較高。我們將找到的錯(cuò)義突變與 nephrin 蛋白功能域相對(duì)應(yīng)繪制成如圖 2-4 所示。我國 FSGS 患者突變主要集中在 Ig1，Ig3，Ig7 和 C-末端細(xì)胞跨膜區(qū)域，這與前期研究報(bào)道顯示在 Ig1 和 Ig7 結(jié)構(gòu)域中觀察到多數(shù) NPHS1 突變的情況一致。說明這些結(jié)構(gòu)域可能為 NPHS1 基因突變的熱點(diǎn)功能域。

第三章 COL4A5 基因新突變?cè)诶^發(fā)性 FSGS 患者中的報(bào)道 7）12,000 rpm 條件下離心兩分鐘后棄廢液。將吸附柱 CB3 室溫條時(shí)間，使內(nèi)壁上殘余的 PW 揮發(fā)干凈。8）將吸附柱轉(zhuǎn)入提前滅菌離心管中，槍頭位置控制在中部上空滴沖液 TE，室溫放置數(shù)分鐘。9）12,000 rpm 條件下離心兩分鐘，將溶液收集到離心管中備用。果家系調(diào)查 3-2 所示，先證者過去沒有明顯病史，其母親于先證者發(fā)病時(shí)間毒癥逝世，其外婆去世病因不詳。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 彭婷;李貴森;;載脂蛋白L1基因突變及其相關(guān)疾病的研究進(jìn)展[J];中華腎臟病雜志;2016年05期

本文編號(hào)：2878377