研究背景及目的:常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是最常見的遺傳性腎臟病,其在人群中的發(fā)病率約為1:400~1:1000。大多數(shù)患者于青年時(shí)期發(fā)病,主要病理改變?yōu)槟I小管進(jìn)行性囊性擴(kuò)張,壓迫正常的腎臟結(jié)構(gòu),破壞腎臟功能,最終導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)。約50%的ADPKD患者在60歲時(shí)進(jìn)展至ESRD,只能依賴透析或者腎移植維持生命,給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前已經(jīng)明確ADPKD的致病基因?yàn)橥蛔兊腜kd1和Pkd2基因(分別編碼多囊蛋白1和多囊蛋白2),其中,Pkd1基因突變占85%。盡管ADPKD的主要致病基因已經(jīng)明確,然而由于Pkd1基因編碼序列過長,突變位點(diǎn)及突變方式變化多端,使得其臨床表現(xiàn)在不同遺傳家系之間存在巨大差異;然而隨著研究的深入,我們發(fā)現(xiàn),盡管在同一個(gè)遺傳家系之內(nèi),乃至同卵雙胞胎之間,該疾病的進(jìn)展與預(yù)后仍存在著很大差異,這提示我們,除了基因本身的突變之外,基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等表觀遺傳學(xué)過程也會對該疾病的進(jìn)程起到很大的影響作用。而基因的甲基化是一種非常重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。因此,我們課題組對多囊腎病患者的腎臟標(biāo)本進(jìn)行了甲基化測序,發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白啟動子區(qū)域存在基因甲基化水平升高,提示該蛋白在多囊腎病的發(fā)病進(jìn)程中可能存在表達(dá)下調(diào)。Klotho蛋白(也作α-Klotho蛋白)是一種主要表達(dá)于遠(yuǎn)端腎小管及大腦的Ⅰ型膜蛋白,由KL基因編碼。該蛋白由KL1和KL2兩個(gè)亞基組成,可以被去整合素和金屬蛋白酶(A desintegrin and metalloproteinase,ADAM)10和ADAM17切割為不同長度的片段并釋放進(jìn)入血液、尿液及腦脊液中,成為一種內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌因子,同多種受體結(jié)合,作用于其他細(xì)胞,其中起到最主要作用的是可溶性全長Klotho蛋白。1997年,Kuro-o等人發(fā)現(xiàn),Klotho基因5’端插入突變的小鼠會出現(xiàn)多種衰老相關(guān)體征,且壽命明顯縮短。研究發(fā)現(xiàn),Klotho蛋白不僅調(diào)控衰老過程,還參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,如腫瘤、二型糖尿病、心肌肥厚和慢性腎衰竭。目前已有相關(guān)臨床研究證實(shí),ADPKD患者血清中Klotho蛋白水平降低,且與腎臟總體積負(fù)相關(guān)。除此之外,Klotho蛋白作為一種具有抑制炎性反應(yīng)作用的因子,能夠調(diào)控TGF-β、Akt、Wnt和TNF-α等相關(guān)信號通路,而這些通路在常染色體多囊腎病的發(fā)病進(jìn)程中均起到重要作用,因此探究Klotho蛋白在常染色體顯性多囊腎病囊腫發(fā)生及生長的過程中起到的作用具有重要意義。本研究擬探究Klotho蛋白在多囊腎病細(xì)胞系及組織中的表達(dá)情況,明確Pkd1突變對Klotho蛋白表達(dá)的影響,以及Klotho蛋白在ADPKD囊腫發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制,為疾病的治療提供新的作用靶點(diǎn)。研究方法:(1)收集臨床ADPKD患者腎臟組織樣本及正常腎臟組織樣本,Pkd1條件敲除小鼠腎臟組織樣本及野生型小鼠腎臟樣本,Pkd1~(+/-)和Pkd~(-/-)腎臟上皮細(xì)胞系,利用蛋白免疫印跡、免疫組織化學(xué)和RT-PCR技術(shù),檢測其中Klotho蛋白的表達(dá)情況。(2)建立晚期誘導(dǎo)PKD1~(fl/fl):tamoxifen-cre小鼠模型,模擬ADPKD發(fā)病真實(shí)情況,進(jìn)一步觀察鼠重組Klotho蛋白對囊腫生成的調(diào)控作用。(3)通過蛋白免疫印跡檢測c-Myc,Cyclin D1,p-STAT3等蛋白水平,驗(yàn)證Klotho對小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。(4)通過對ADPKD患者腎臟組織及正常腎臟組織的基因甲基化測序,明確Klotho在ADPKD中表達(dá)下調(diào)的原因,并通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù),驗(yàn)證DNMT1蛋白與Klotho啟動子區(qū)域結(jié)合情況;通過蛋白免疫印跡技術(shù)檢測DNMT1蛋白與Klotho蛋白的調(diào)控環(huán)路。(5)通過蛋白免疫印跡技術(shù)及RT-PCR技術(shù),分別檢測Smyd2、p-P65、TNF-α、Ccl-2的表達(dá)水平,明確Klotho對小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。(6)通過細(xì)胞流式技術(shù)檢測C11:BODIPY581/591在小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞染色的陽性率,蛋白免疫印跡技術(shù)及RT-PCR技術(shù)檢測GPX-4在小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞及小鼠腎臟中的表達(dá)情況,并進(jìn)行細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn),明確Klotho對鐵死亡過程的影響作用;(7)通過小鼠腎臟組織Masson染色、α-SMA染色、Collagen-Ⅰ染色,以及小鼠腎臟組織蛋白免疫印跡技術(shù)檢測TGF-β、Fibronectin、α-SMA、p-smad2/3蛋白水平,明確Klotho對ADPKD中的纖維化過程的抑制作用;在大鼠成纖維細(xì)胞中驗(yàn)證TGF-β對Klotho表達(dá)的抑制作用。結(jié)果:(1)Klotho蛋白在ADPKD患者腎臟組織、小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮及PKD1~(fl/fl):Pkhd1-cre小鼠腎臟組織中表達(dá)下調(diào)。(2)在晚期誘導(dǎo)PKD1~(fl/fl):tamoxifen-cre小鼠模型中,腹腔注射鼠重組Klotho蛋白能夠延緩ADPKD病情進(jìn)展,改善腎功能,減緩腎臟體積增長速度。(3)鼠重組Klotho蛋白能夠下調(diào)小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞增殖相關(guān)通路蛋白水平,抑制細(xì)胞增殖。(4)ADPKD患者腎臟組織基因甲基化測序提示,Klotho基因在ADPKD腎臟中,啟動子及基因體區(qū)域高度甲基化。甲基化特別是啟動序列的甲基化會使基因沉默,表達(dá)下調(diào)。(5)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)在小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),Klotho基因啟動子區(qū)域與DNMT1存在結(jié)合。(6)DNMT1抑制劑Hydralazin處理小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞能夠上調(diào)Klotho蛋白表達(dá)水平;同時(shí),鼠重組Klotho蛋白能夠下調(diào)小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞及ADPKD小鼠腎臟組織中的DNMT1水平。(7)鼠重組Klotho蛋白能夠下調(diào)Smyd2及p-P65蛋白水平,抑制TNF-α和Ccl-2表達(dá),從而抑制細(xì)胞及小鼠ADPKD腎臟組織的炎性反應(yīng)。(8)鼠重組Klotho蛋白處理小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞后,以MTT檢測細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)盡管Klotho蛋白能夠抑制多條細(xì)胞增殖相關(guān)通路,然而Klotho處理組存活細(xì)胞數(shù)量較對照組并無下降,甚至還有輕微升高趨勢,提示Klotho處理可能抑制某種細(xì)胞死亡過程。(9)鼠重組Klotho蛋白能夠上調(diào)小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞及小鼠ADPKD腎臟組織中GPX-4的表達(dá)水平,抑制鐵死亡發(fā)生。(10)流式細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),鼠重組Klotho蛋白處理小鼠PKD1~(-/-)腎小管上皮細(xì)胞后,C11:BODIPY581/591染色陽性細(xì)胞比例下降,提示Klotho能夠減輕細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化情況,從而抑制鐵死亡發(fā)生。(11)Masson染色、α-SMA染色及Collagen-Ⅰ染色提示,外源性補(bǔ)充Klotho蛋白能夠抑制ADPKD中的纖維化進(jìn)程;同時(shí),Klotho處理能夠下調(diào)ADPKD小鼠腎臟組織中的纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步證實(shí)其對纖維化進(jìn)程的抑制作用。(12)TGF-β處理大鼠成纖維細(xì)胞能夠抑制Klotho蛋白表達(dá)。結(jié)論:(1)Klotho蛋白在ADPKD囊腫發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用;(2)DNMT1引起的Klotho基因啟動子區(qū)域甲基化水平升高,是導(dǎo)致Klotho蛋白在ADPKD中表達(dá)下調(diào)的主要原因;(3)Klotho蛋白能夠通過影響ADPKD發(fā)病過程中細(xì)胞的增殖、死亡、炎性反應(yīng)及纖維化進(jìn)程等方面,調(diào)控ADPKD病情進(jìn)展。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：
p<0.001。實(shí)驗(yàn)結(jié)果Klotho 蛋白在 Pkd1 敲除腎臟上皮細(xì)胞系中的白在正常的腎小管上皮中表達(dá)，為了初步驗(yàn)證在 Pkd1 缺，我們選取了兩組 Pkd1 突變腎臟上皮細(xì)胞系，分別代表d1 突變的病理生理情況，并通過 RT-PCR 驗(yàn)證 Klotho 基因，以及蛋白免疫印跡驗(yàn)證 Klotho 蛋白的表達(dá)情況。lotho 蛋白在小鼠 Pkd1-/-和 Pkd1+/-腎小管上皮細(xì)胞驗(yàn)通過 RT-PCR（圖 1-1A）驗(yàn)證了相較 Pkd1+/-腎小管上皮胞系的 Klotho 基因在轉(zhuǎn)錄水平上明顯下調(diào)（t 檢驗(yàn)，1.001 ±0.03802%，P=0.0016，t=7.668）；而后又通過蛋白免疫Klotho 蛋白水平在 Pkd1 突變的腎小管上皮中明顯下降（圖環(huán)境下，Pkd1 基因突變對 Klotho 蛋白表達(dá)的影響。
. Klotho 蛋白在小鼠胚腎 Pkd1 WT 和 Pkd1 null MEK 細(xì)胞系）Klotho 蛋白在 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre 小鼠中的表kd1fl/fl：Pkhd-cre小鼠的繁育及基因鑒定型為 Pkd1fl/+：Pkhd-cre（+）的適應(yīng)公鼠和母鼠合籠，待母鼠產(chǎn)鼠的出生日期，在小鼠出生第五天進(jìn)行剪腳趾編號，并將剪下基因鑒定，見圖 1-3。其中，基因型為 F4R5(-/-)Cre(+)為 PKre（-）及 F4R5（+/+）Cre（+）的小鼠可作為野生型對照。
圖 1-2. Klotho 蛋白在小鼠胚腎 Pkd1 WT 和 Pkd1 null MEK 細(xì)胞系的表達(dá)（二）Klotho 蛋白在 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre 小鼠中的表達(dá)1、 Pkd1fl/fl：Pkhd-cre小鼠的繁育及基因鑒定將基因型為 Pkd1fl/+：Pkhd-cre（+）的適應(yīng)公鼠和母鼠合籠，待母鼠產(chǎn)下小鼠后，確記錄小鼠的出生日期，在小鼠出生第五天進(jìn)行剪腳趾編號，并將剪下的腳趾及鼠組織進(jìn)行基因鑒定，見圖 1-3。其中，基因型為 F4R5(-/-)Cre(+)為 PKD 發(fā)病小鼠，因型為 Cre（-）及 F4R5（+/+）Cre（+）的小鼠可作為野生型對照。
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本文編號：
2878062
