發(fā)布時(shí)間：2020-11-08 20:42

　　 不孕癥是指一年未采取任何避孕措施,性生活正常而沒有成功妊娠,其中單純男性因素占40%左右,雙方因素約為20%。近年來據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),因男性因素而尋求輔助生殖技術(shù)治療的比例在逐漸上升,其中約有10%-15%的男性是因?yàn)檫z傳學(xué)因素導(dǎo)致的不育,但沒有相應(yīng)的臨床治療方法去改善因遺傳學(xué)因素導(dǎo)致的男性不育狀況。這就迫切的需求我們?nèi)フJ(rèn)知精子發(fā)生過程的分子生物學(xué)機(jī)制。精子發(fā)生(Spermatogenesis)是指睪丸生殖干細(xì)胞在經(jīng)過減數(shù)分裂和有絲分裂分化為精原細(xì)胞,并通過形態(tài)學(xué)的改變最終分化為成熟精子細(xì)胞的一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程。大約有3000個(gè)基因涉及到生精干細(xì)胞的分化和發(fā)展過程,但是對(duì)于精子發(fā)生的分子機(jī)制,尚未完全闡明,所以對(duì)于鑒定和了解在精子發(fā)生過程中的新的關(guān)鍵基因,闡明精子發(fā)生的分子機(jī)制,對(duì)于人類生殖健康、男性不育的防治、與避孕疫苗的研發(fā)是十分重要的。通過乙�；鶃喯趸�脲(Ethylnitrosourea,ENU)隨機(jī)突變方法,我們發(fā)現(xiàn)和鑒定了一個(gè)新的小鼠精子發(fā)生相關(guān)基因:lrguk(Leucine-Rich repeats and Guanylate Kinase domain containing)。lrguk在小鼠中有3個(gè)轉(zhuǎn)錄子,其中轉(zhuǎn)錄子1(lrguk-1)長度為3058bp,編碼長度為820個(gè)氨基酸,長度為93k Da的蛋白,小鼠的lrguk-1共含有20個(gè)外顯子,在lrguk-1的14號(hào)外顯子一個(gè)CàT的點(diǎn)突變導(dǎo)致在LRGUK的第528位的氨基酸(精氨酸)突變?yōu)榻K止子,導(dǎo)致蛋白編碼的提前終止,產(chǎn)生一個(gè)截?cái)嗟鞍?并導(dǎo)致雄性小鼠的不育。lrguk-1突變小鼠,主要表現(xiàn)為純合型突變雄性小鼠的完全不育,具體表現(xiàn)為精子數(shù)目的減少,精子形態(tài)的畸形及精子活力的喪失,即重度少弱精癥(OAT),睪丸組織切片HE染色顯示睪丸精子發(fā)生過程紊亂,所以在此次研究中我們用Kaos來命名這個(gè)突變小鼠系(Chaotic spermatogenesis),lrguk-1雜合型突變雄性小鼠及l(fā)rguk-1純合型突變雌性小鼠的生育力并不受任何影響。目前還沒有關(guān)于lrguk基因功能研究的任何報(bào)道,因此我們對(duì)lrguk基因與雄性小鼠生殖力及其在精子發(fā)生過程的功能進(jìn)行了初步研究。第一部分lrguk與雄性小鼠生殖力的關(guān)系研究目的:通過研究lrguk-1Kaos/Kaos小鼠(純合型lrguk突變雄性小鼠)和lrguk-1WT/WT小鼠(野生型雄性小鼠)的睪丸組織精子發(fā)生的對(duì)比,探討lrguk-1與雄性小鼠生殖力之間的關(guān)系,及其lrguk-1在男性精子發(fā)生過程的功能。研究方法:比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠PAS染色睪丸組織切片分析睪丸結(jié)構(gòu)差異、比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠HE染色附睪組織切片比較分析精子數(shù)目;比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠HE染色成熟精子形態(tài)學(xué)對(duì)比;比較分析成年(8周,n=5)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸日精子產(chǎn)量差異(Daily sperm producitn,DSP);比較分析成年(8周,n=5)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠附睪精子數(shù)目對(duì)比(Daily sperm producitn,DSP);比較分析分別day0、day7、day14、day18、day20、day30、day60出生小鼠的睪丸組織lrguk-1表達(dá);比較分析lrguk-1在睪丸、肝臟、肺臟、腦、支氣管、卵巢等多種組織中的表達(dá);通過stereology方法比較分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠各階段精子細(xì)胞數(shù)目的差異(Sg:Spermatogonia精原細(xì)胞;e Sc,early Spermatocyte,早期精母細(xì)胞;l Sc,late Spermatocyte晚期精母細(xì)胞;r ST,round spermatid圓形精子細(xì)胞;el ST,elongating spermatids變形期精子細(xì)胞;ret,retained Spermatids滯留精子細(xì)胞),比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織凋亡情況分析;比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織γ-H2AX表達(dá)對(duì)比。結(jié)果:1.純合lrguk-1突變可以導(dǎo)致雄性小鼠的不育;2.lrguk-1主要是在睪丸組織內(nèi)高表達(dá),且在一些含纖毛組織(肺、腦、腎臟等)微量表達(dá);3.lrguk-1的表達(dá)在減數(shù)分裂開始時(shí)進(jìn)行表達(dá),在第一波生精波完成時(shí)達(dá)到高峰;4.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠相比,睪丸體重有13%的減少,有顯著性差異(P0.05),日精子產(chǎn)量有81%的減少,有顯著性差異(P0.001);附睪精子總數(shù)目有79%的差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001);5.stereology比較分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸各級(jí)別精子數(shù)目:精原細(xì)胞有23.46%減少,,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),變形期精子細(xì)胞有33.11%減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠stage IX期曲細(xì)精管內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量滯留精子細(xì)胞。6.PAS染色成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織切片結(jié)果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠睪丸各級(jí)生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常,圓形精子細(xì)胞周圍開始出現(xiàn)頂體碎片,精子細(xì)胞數(shù)目減少、精子頭部形態(tài)學(xué)畸形及精子尾部形態(tài)學(xué)畸形或缺失;7.HE染色lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠附睪組織切片結(jié)果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠附睪內(nèi)精子數(shù)目減少,精子形態(tài)學(xué)畸形及精原細(xì)胞脫落;8.HE染色精子結(jié)果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠成熟精子有精子頭部畸形及精子尾部形態(tài)學(xué)畸形或缺失;精子活力喪失。9.成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠的睪丸組織凋亡率無顯著性差異,但是γ-H2AX在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠變形期精子細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。結(jié)論:1.lrguk在小鼠中有3個(gè)轉(zhuǎn)錄子,目前證實(shí)lrguk-1與男性生殖力有著密切的關(guān)系。2.lrguk-1是一個(gè)睪丸特異基因,在減數(shù)分裂開始時(shí)進(jìn)行表達(dá),并在第一波生精波完成時(shí)幾乎達(dá)到高峰。3.lrguk-1主要由含纖毛組織表達(dá):如睪丸、支氣管、腦、腎臟等。4.lrguk-1第14號(hào)外顯子的基因突變導(dǎo)致睪丸精子發(fā)生障礙,主要變現(xiàn)為精子數(shù)目的減少、精子形態(tài)學(xué)異常及精子活力喪失即重度少弱畸精子癥:(oligo-atheno-terato-spermia,OAT)。第二部分LRGUK-1與精子頭部塑形的功能研究研究目的:通過對(duì)成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織和不同階段精子細(xì)胞中的LRGUK的表達(dá)及其定位,成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠不同階段精子及其超微結(jié)構(gòu)的差異,及與候選蛋白R(shí)IM-BP3的功能驗(yàn)證,來闡述LRGUK在精子頭部塑形過程的功能及其分子機(jī)制探討。研究方法:利用STAPUT方法,獲得成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠不同階段的精子細(xì)胞和睪丸組織切片,利用特異性LRGUK抗體,與頂體標(biāo)記物PNA、manchette標(biāo)記物α-tubulin、鞭毛標(biāo)記物acetylated tubulin進(jìn)行免疫熒光共定位研究;電子顯微鏡分析比較成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織和精子細(xì)胞的頂體發(fā)、manchette、perinuclear ring、基部小體、中心粒附屬器等結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu);利用免疫熒光共定位、GFP-pull down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LRGUK與RIM-BP3的結(jié)合。結(jié)果:1.免疫熒光染色結(jié)果顯示LRGUK首先定位于圓形精子細(xì)胞的頂體,隨著精子細(xì)胞的分化,LRGUK逐漸遷移至Acroplaxome部位,接著在精子頭部塑形過程中,LRGUK定位于manchette微管結(jié)構(gòu)中,隨著精子尾部的形成,LRGUK定位于精子的基部小體,并且最終定位于精子鞭毛軸絲上。2.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠最先出現(xiàn)的異常為頂體碎片的出現(xiàn),電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)10%延長期精子細(xì)胞頂體與精子細(xì)胞核分離,且高爾基體分泌的頂體前囊泡表面不平滑。3.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠manchette結(jié)構(gòu)起始及消失的時(shí)間正常,向精子尾部的遷移大致正常,但是manchette結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)異常,表現(xiàn)為微管分布不平行,出現(xiàn)撕裂狀態(tài);結(jié)構(gòu)異常分散、少數(shù)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核分離;電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)證實(shí)了manchette結(jié)構(gòu)異常,同時(shí)發(fā)現(xiàn)異�？s窄的perinuclear ring結(jié)構(gòu)。4.大量的截?cái)郘RGUK-1蛋白堆積在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠acroplaxome結(jié)構(gòu)處;lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子頭部形態(tài)學(xué)的畸形改變。5.免疫熒光染色分析LRGUK與manchette結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白R(shí)IM-BP3共定位于manchette結(jié)構(gòu),并用細(xì)胞轉(zhuǎn)染及GFP-pull down和免疫共沉淀驗(yàn)證LRGUK與RIM-BP3的結(jié)合。結(jié)論:1.LRGUK-1可能通過參與高爾基體分泌的頂體前囊泡的運(yùn)輸和融合參與精子頂體形和acroplaxome結(jié)構(gòu)形成;LRGUK-1參與manchette結(jié)構(gòu)形成。2.LRGUK-1 C末端的293個(gè)氨基酸在蛋白質(zhì)從acroplaxome到manchette的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到關(guān)鍵作用。3.LRGUK-1通過Acrosome-Acroplaxome-Manchette復(fù)合體參與精子頭部的塑形。4.LRGUK-1是一種支架蛋白,與RIM-BP3共同作用于acrosomeacroplaxome-manchette復(fù)合體參與精子頭部的塑形和蛋白質(zhì)的運(yùn)輸。第三部分LRGUK-1在小鼠精子尾部發(fā)生和延伸的功能研究研究目的:通過比較成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠精子活力,睪丸組織內(nèi)精子尾部結(jié)構(gòu)和數(shù)目,精子尾部軸絲的起始和延伸和基部小體及中心粒附屬器超微結(jié)構(gòu)的對(duì)比,及與候選蛋白HOOK2的功能驗(yàn)證,并利用ARPE-19細(xì)胞系作為纖毛模型,擬闡述LRGUK在小鼠精子尾部軸絲發(fā)生及延伸過程中的作用機(jī)制。研究方法:光學(xué)顯微鏡下觀察和對(duì)比成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠精子活力,免疫組織化學(xué)分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織中精子尾部結(jié)構(gòu)和數(shù)目的差異;電子顯微鏡比較lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠尾部起始和延伸,及基部小體和中心粒附屬器超微結(jié)構(gòu)的差異;利用基因沉默技術(shù)來降低ARPE-19細(xì)胞系中l(wèi)rguk-1的表達(dá),來研究LRGUK-1在纖毛發(fā)生過程的作用,利用免疫熒光共定位、GFP-pull down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LRGUK與HOOK2的結(jié)合。結(jié)果:1.光學(xué)顯微鏡觀察lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子無活力。2.成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織切片結(jié)果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠尾部缺失或形態(tài)學(xué)異常。3.電子顯微鏡結(jié)果顯示lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子尾部起始障礙及尾部延伸阻滯。4.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子尾部基部小體的“9×2+2”結(jié)構(gòu)喪失,中心粒附屬器超微結(jié)構(gòu)顯示大多數(shù)遠(yuǎn)端中心粒附屬器結(jié)構(gòu)大致正常,但大多數(shù)不與細(xì)胞膜粘附;近端中心粒附屬器的結(jié)構(gòu)形態(tài)異常。5.利用sh RNA進(jìn)行l(wèi)rguk-1在ARPE-19細(xì)胞系進(jìn)行基因沉默技術(shù),lrguk-1表達(dá)下調(diào)對(duì)ARPE-19細(xì)胞系生長速度、初級(jí)纖毛的數(shù)目及長度及中心粒結(jié)構(gòu)并不受影響。6.LRGUK與HOOK2共定位與manchette結(jié)構(gòu)與精子尾部基部小體,并用細(xì)胞轉(zhuǎn)染及GFP-pull down和免疫共沉淀驗(yàn)證LRGUK與HOOK2的結(jié)合。結(jié)論:1.Lrguk-1在小鼠精子尾部形成與延伸過程起到關(guān)鍵作用。2.Lrguk-1可能通過作用與近端中心粒附屬器影響鞭毛微管結(jié)構(gòu)的形成在精子鞭毛發(fā)生過程起到關(guān)鍵作用。3.Lrguk-1可能通過與HOOK2相互作用,通過鞭毛內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸(intra-flagellar transport)和manchette結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)運(yùn)輸(Intra manchette transport)來參與精子尾部的形成。4.Lrguk-1可能對(duì)初級(jí)纖毛沒有功能影響,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R698.2
【部分圖文】：

Kaos/Kaos小鼠和 lrguk-1WT/WT小鼠基本情況對(duì)比uk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠的體重有顯著性差異(p<0.034, n=14)，且成年 lrguk-1Kaos/Kao，但性生活能力正常，同時(shí)成年 lrguk-1Kaos/Kaos雌雄性小鼠的生育能力均正常。（見圖 1）

直至在圓形精子細(xì)胞周圍發(fā)現(xiàn)了頂體的碎片，且精子細(xì)胞數(shù)目減少及表現(xiàn)為精子數(shù)目的畸形及尾部的缺失。（圖1.2）圖 1.2 睪丸組織的 PAS 染色切片：a)成年的 lrgukWT/WT雄性小鼠的睪丸組織切片； 成年的lrgukKaos/Kaos雄性小鼠的睪丸組織切片：b)組織結(jié)構(gòu)與 lrgukWT/WT雄性小鼠的睪丸組織切片相似，直至頂體碎片的出現(xiàn)(紅色箭頭)；c) 在 VII-XII 階段曲細(xì)精管內(nèi) retained 精子細(xì)胞(黑色箭頭)。*代表曲細(xì)精管管腔, Scale Bar=100μm.Stereological 分析了成年 lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠不同階段精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、精子細(xì)胞及支持細(xì)胞數(shù)目的對(duì)比(成年 lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠各 5 只)，其中精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞/睪丸在 lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠中并無顯著性差異，但是在 lrguk-1Kaos/Kaos小鼠中，精原細(xì)胞和精子細(xì)胞/支持細(xì)胞相對(duì)于 lrguk-1WT/WT小鼠有顯著性下降(23.46% , p<0.02 和 31.11%，p<0.01)。同時(shí)，在 VII-XII 階段曲細(xì)精管內(nèi) retained 精子細(xì)胞在 lrguk-1Kaos/Kaos小鼠比lrguk-1WT/WT小鼠高出 18 倍。（圖 1.3）

ological 分析各階段生精細(xì)胞/支持細(xì)胞在 lrguk-1Kaos/Kaos/lrg胞在 lrguk-1Kaos/Kaos/lrguk-1WT/WT的倍數(shù)(右圖)。簡(jiǎn)寫： Sg: cyte; lSc:late spermatocyte; rST: round spermatids; eST: elongatating spermatids.lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小子 HE 染色對(duì)比guk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠 HE 染k-1Kaos/Kaos雄性小鼠的附睪組織內(nèi)的精子數(shù)目嚴(yán)重減生精干細(xì)胞(綠色箭頭所示)。HE 染色的成os雄性小鼠的精子表現(xiàn)為頭部的形態(tài)的嚴(yán)重畸形及精常。（圖 1.4）
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本文編號(hào)：2875309