發(fā)布時間：2020-11-08 20:42

　　 不孕癥是指一年未采取任何避孕措施,性生活正常而沒有成功妊娠,其中單純男性因素占40%左右,雙方因素約為20%。近年來據不完全統(tǒng)計,因男性因素而尋求輔助生殖技術治療的比例在逐漸上升,其中約有10%-15%的男性是因為遺傳學因素導致的不育,但沒有相應的臨床治療方法去改善因遺傳學因素導致的男性不育狀況。這就迫切的需求我們去認知精子發(fā)生過程的分子生物學機制。精子發(fā)生(Spermatogenesis)是指睪丸生殖干細胞在經過減數(shù)分裂和有絲分裂分化為精原細胞,并通過形態(tài)學的改變最終分化為成熟精子細胞的一系列復雜的生物學過程。大約有3000個基因涉及到生精干細胞的分化和發(fā)展過程,但是對于精子發(fā)生的分子機制,尚未完全闡明,所以對于鑒定和了解在精子發(fā)生過程中的新的關鍵基因,闡明精子發(fā)生的分子機制,對于人類生殖健康、男性不育的防治、與避孕疫苗的研發(fā)是十分重要的。通過乙酰基亞硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)隨機突變方法,我們發(fā)現(xiàn)和鑒定了一個新的小鼠精子發(fā)生相關基因:lrguk(Leucine-Rich repeats and Guanylate Kinase domain containing)。lrguk在小鼠中有3個轉錄子,其中轉錄子1(lrguk-1)長度為3058bp,編碼長度為820個氨基酸,長度為93k Da的蛋白,小鼠的lrguk-1共含有20個外顯子,在lrguk-1的14號外顯子一個CàT的點突變導致在LRGUK的第528位的氨基酸(精氨酸)突變?yōu)榻K止子,導致蛋白編碼的提前終止,產生一個截斷蛋白,并導致雄性小鼠的不育。lrguk-1突變小鼠,主要表現(xiàn)為純合型突變雄性小鼠的完全不育,具體表現(xiàn)為精子數(shù)目的減少,精子形態(tài)的畸形及精子活力的喪失,即重度少弱精癥(OAT),睪丸組織切片HE染色顯示睪丸精子發(fā)生過程紊亂,所以在此次研究中我們用Kaos來命名這個突變小鼠系(Chaotic spermatogenesis),lrguk-1雜合型突變雄性小鼠及l(fā)rguk-1純合型突變雌性小鼠的生育力并不受任何影響。目前還沒有關于lrguk基因功能研究的任何報道,因此我們對lrguk基因與雄性小鼠生殖力及其在精子發(fā)生過程的功能進行了初步研究。第一部分lrguk與雄性小鼠生殖力的關系研究目的:通過研究lrguk-1Kaos/Kaos小鼠(純合型lrguk突變雄性小鼠)和lrguk-1WT/WT小鼠(野生型雄性小鼠)的睪丸組織精子發(fā)生的對比,探討lrguk-1與雄性小鼠生殖力之間的關系,及其lrguk-1在男性精子發(fā)生過程的功能。研究方法:比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠PAS染色睪丸組織切片分析睪丸結構差異、比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠HE染色附睪組織切片比較分析精子數(shù)目;比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠HE染色成熟精子形態(tài)學對比;比較分析成年(8周,n=5)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸日精子產量差異(Daily sperm producitn,DSP);比較分析成年(8周,n=5)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠附睪精子數(shù)目對比(Daily sperm producitn,DSP);比較分析分別day0、day7、day14、day18、day20、day30、day60出生小鼠的睪丸組織lrguk-1表達;比較分析lrguk-1在睪丸、肝臟、肺臟、腦、支氣管、卵巢等多種組織中的表達;通過stereology方法比較分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠各階段精子細胞數(shù)目的差異(Sg:Spermatogonia精原細胞;e Sc,early Spermatocyte,早期精母細胞;l Sc,late Spermatocyte晚期精母細胞;r ST,round spermatid圓形精子細胞;el ST,elongating spermatids變形期精子細胞;ret,retained Spermatids滯留精子細胞),比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織凋亡情況分析;比較分析成年(8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織γ-H2AX表達對比。結果:1.純合lrguk-1突變可以導致雄性小鼠的不育;2.lrguk-1主要是在睪丸組織內高表達,且在一些含纖毛組織(肺、腦、腎臟等)微量表達;3.lrguk-1的表達在減數(shù)分裂開始時進行表達,在第一波生精波完成時達到高峰;4.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠相比,睪丸體重有13%的減少,有顯著性差異(P0.05),日精子產量有81%的減少,有顯著性差異(P0.001);附睪精子總數(shù)目有79%的差異,有統(tǒng)計學差異(P0.001);5.stereology比較分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸各級別精子數(shù)目:精原細胞有23.46%減少,,有統(tǒng)計學差異(P0.01),變形期精子細胞有33.11%減少,有統(tǒng)計學差異(P0.01),在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠stage IX期曲細精管內發(fā)現(xiàn)大量滯留精子細胞。6.PAS染色成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織切片結果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠睪丸各級生精細胞結構大致正常,圓形精子細胞周圍開始出現(xiàn)頂體碎片,精子細胞數(shù)目減少、精子頭部形態(tài)學畸形及精子尾部形態(tài)學畸形或缺失;7.HE染色lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠附睪組織切片結果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠附睪內精子數(shù)目減少,精子形態(tài)學畸形及精原細胞脫落;8.HE染色精子結果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠成熟精子有精子頭部畸形及精子尾部形態(tài)學畸形或缺失;精子活力喪失。9.成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠的睪丸組織凋亡率無顯著性差異,但是γ-H2AX在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠變形期精子細胞內高表達。結論:1.lrguk在小鼠中有3個轉錄子,目前證實lrguk-1與男性生殖力有著密切的關系。2.lrguk-1是一個睪丸特異基因,在減數(shù)分裂開始時進行表達,并在第一波生精波完成時幾乎達到高峰。3.lrguk-1主要由含纖毛組織表達:如睪丸、支氣管、腦、腎臟等。4.lrguk-1第14號外顯子的基因突變導致睪丸精子發(fā)生障礙,主要變現(xiàn)為精子數(shù)目的減少、精子形態(tài)學異常及精子活力喪失即重度少弱畸精子癥:(oligo-atheno-terato-spermia,OAT)。第二部分LRGUK-1與精子頭部塑形的功能研究研究目的:通過對成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織和不同階段精子細胞中的LRGUK的表達及其定位,成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠不同階段精子及其超微結構的差異,及與候選蛋白RIM-BP3的功能驗證,來闡述LRGUK在精子頭部塑形過程的功能及其分子機制探討。研究方法:利用STAPUT方法,獲得成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠不同階段的精子細胞和睪丸組織切片,利用特異性LRGUK抗體,與頂體標記物PNA、manchette標記物α-tubulin、鞭毛標記物acetylated tubulin進行免疫熒光共定位研究;電子顯微鏡分析比較成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織和精子細胞的頂體發(fā)、manchette、perinuclear ring、基部小體、中心粒附屬器等結構超微結構;利用免疫熒光共定位、GFP-pull down和免疫共沉淀實驗驗證LRGUK與RIM-BP3的結合。結果:1.免疫熒光染色結果顯示LRGUK首先定位于圓形精子細胞的頂體,隨著精子細胞的分化,LRGUK逐漸遷移至Acroplaxome部位,接著在精子頭部塑形過程中,LRGUK定位于manchette微管結構中,隨著精子尾部的形成,LRGUK定位于精子的基部小體,并且最終定位于精子鞭毛軸絲上。2.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠最先出現(xiàn)的異常為頂體碎片的出現(xiàn),電子顯微鏡超微結構發(fā)現(xiàn)10%延長期精子細胞頂體與精子細胞核分離,且高爾基體分泌的頂體前囊泡表面不平滑。3.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠manchette結構起始及消失的時間正常,向精子尾部的遷移大致正常,但是manchette結構形態(tài)學異常,表現(xiàn)為微管分布不平行,出現(xiàn)撕裂狀態(tài);結構異常分散、少數(shù)結構與細胞核分離;電子顯微鏡超微結構證實了manchette結構異常,同時發(fā)現(xiàn)異常縮窄的perinuclear ring結構。4.大量的截斷LRGUK-1蛋白堆積在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠acroplaxome結構處;lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子頭部形態(tài)學的畸形改變。5.免疫熒光染色分析LRGUK與manchette結構相關蛋白RIM-BP3共定位于manchette結構,并用細胞轉染及GFP-pull down和免疫共沉淀驗證LRGUK與RIM-BP3的結合。結論:1.LRGUK-1可能通過參與高爾基體分泌的頂體前囊泡的運輸和融合參與精子頂體形和acroplaxome結構形成;LRGUK-1參與manchette結構形成。2.LRGUK-1 C末端的293個氨基酸在蛋白質從acroplaxome到manchette的轉運過程中起到關鍵作用。3.LRGUK-1通過Acrosome-Acroplaxome-Manchette復合體參與精子頭部的塑形。4.LRGUK-1是一種支架蛋白,與RIM-BP3共同作用于acrosomeacroplaxome-manchette復合體參與精子頭部的塑形和蛋白質的運輸。第三部分LRGUK-1在小鼠精子尾部發(fā)生和延伸的功能研究研究目的:通過比較成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠精子活力,睪丸組織內精子尾部結構和數(shù)目,精子尾部軸絲的起始和延伸和基部小體及中心粒附屬器超微結構的對比,及與候選蛋白HOOK2的功能驗證,并利用ARPE-19細胞系作為纖毛模型,擬闡述LRGUK在小鼠精子尾部軸絲發(fā)生及延伸過程中的作用機制。研究方法:光學顯微鏡下觀察和對比成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠精子活力,免疫組織化學分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織中精子尾部結構和數(shù)目的差異;電子顯微鏡比較lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠尾部起始和延伸,及基部小體和中心粒附屬器超微結構的差異;利用基因沉默技術來降低ARPE-19細胞系中l(wèi)rguk-1的表達,來研究LRGUK-1在纖毛發(fā)生過程的作用,利用免疫熒光共定位、GFP-pull down和免疫共沉淀實驗驗證LRGUK與HOOK2的結合。結果:1.光學顯微鏡觀察lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子無活力。2.成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睪丸組織切片結果顯示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠尾部缺失或形態(tài)學異常。3.電子顯微鏡結果顯示lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子尾部起始障礙及尾部延伸阻滯。4.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子尾部基部小體的“9×2+2”結構喪失,中心粒附屬器超微結構顯示大多數(shù)遠端中心粒附屬器結構大致正常,但大多數(shù)不與細胞膜粘附;近端中心粒附屬器的結構形態(tài)異常。5.利用sh RNA進行l(wèi)rguk-1在ARPE-19細胞系進行基因沉默技術,lrguk-1表達下調對ARPE-19細胞系生長速度、初級纖毛的數(shù)目及長度及中心粒結構并不受影響。6.LRGUK與HOOK2共定位與manchette結構與精子尾部基部小體,并用細胞轉染及GFP-pull down和免疫共沉淀驗證LRGUK與HOOK2的結合。結論:1.Lrguk-1在小鼠精子尾部形成與延伸過程起到關鍵作用。2.Lrguk-1可能通過作用與近端中心粒附屬器影響鞭毛微管結構的形成在精子鞭毛發(fā)生過程起到關鍵作用。3.Lrguk-1可能通過與HOOK2相互作用,通過鞭毛內蛋白質運輸(intra-flagellar transport)和manchette結構蛋白質運輸(Intra manchette transport)來參與精子尾部的形成。4.Lrguk-1可能對初級纖毛沒有功能影響,有待進一步驗證。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R698.2
【部分圖文】：

Kaos/Kaos小鼠和 lrguk-1WT/WT小鼠基本情況對比uk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠的體重有顯著性差異(p<0.034, n=14)，且成年 lrguk-1Kaos/Kao，但性生活能力正常，同時成年 lrguk-1Kaos/Kaos雌雄性小鼠的生育能力均正常。（見圖 1）

直至在圓形精子細胞周圍發(fā)現(xiàn)了頂體的碎片，且精子細胞數(shù)目減少及表現(xiàn)為精子數(shù)目的畸形及尾部的缺失。（圖1.2）圖 1.2 睪丸組織的 PAS 染色切片：a)成年的 lrgukWT/WT雄性小鼠的睪丸組織切片； 成年的lrgukKaos/Kaos雄性小鼠的睪丸組織切片：b)組織結構與 lrgukWT/WT雄性小鼠的睪丸組織切片相似，直至頂體碎片的出現(xiàn)(紅色箭頭)；c) 在 VII-XII 階段曲細精管內 retained 精子細胞(黑色箭頭)。*代表曲細精管管腔, Scale Bar=100μm.Stereological 分析了成年 lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠不同階段精原細胞、精母細胞、圓形精子細胞、精子細胞及支持細胞數(shù)目的對比(成年 lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠各 5 只)，其中精母細胞和圓形精子細胞/睪丸在 lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠中并無顯著性差異，但是在 lrguk-1Kaos/Kaos小鼠中，精原細胞和精子細胞/支持細胞相對于 lrguk-1WT/WT小鼠有顯著性下降(23.46% , p<0.02 和 31.11%，p<0.01)。同時，在 VII-XII 階段曲細精管內 retained 精子細胞在 lrguk-1Kaos/Kaos小鼠比lrguk-1WT/WT小鼠高出 18 倍。（圖 1.3）

ological 分析各階段生精細胞/支持細胞在 lrguk-1Kaos/Kaos/lrg胞在 lrguk-1Kaos/Kaos/lrguk-1WT/WT的倍數(shù)(右圖)。簡寫： Sg: cyte; lSc:late spermatocyte; rST: round spermatids; eST: elongatating spermatids.lrguk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小子 HE 染色對比guk-1Kaos/Kaos雄性小鼠和 lrguk-1WT/WT雄性小鼠 HE 染k-1Kaos/Kaos雄性小鼠的附睪組織內的精子數(shù)目嚴重減生精干細胞(綠色箭頭所示)。HE 染色的成os雄性小鼠的精子表現(xiàn)為頭部的形態(tài)的嚴重畸形及精常。（圖 1.4）
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本文編號：2875309