發(fā)布時間：2020-11-08 09:30

　　 研究背景:前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)在世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性發(fā)病人數(shù)第二、死亡人數(shù)第五的腫瘤,其嚴重威脅著中老年男性的生活健康。在美國,前列腺癌是男性發(fā)病率第一、死亡率僅次于肺癌的腫瘤。前列腺癌的發(fā)病率有著明顯的地理差異,在中國,由于人們物質(zhì)生活水平的提高,飲食結構的改變等等,前列腺癌的發(fā)病率雖然遠低于歐美發(fā)達國家的水平,但增長速度越來越快。1998~2008年,我國前列腺癌發(fā)病率年均增加比例約為12.07%,是男性增長率最快的腫瘤。雄激素剝奪治療(ADT)是目前治療晚期前列腺癌病人最有效的方法,但是這些病人最終都會不可避免的進展到去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)階段。盡管目前有多種治療方式在嘗試解決這個問題,如化療(多西他賽、卡巴他塞)、放療、新型研發(fā)的雄激素受體(AR)通路抑制劑(恩雜魯胺、阿比特龍)、Ra-223以及仍處于試驗階段的PARP抑制劑奧拉帕尼等等,無一例外都難以徹底逆轉(zhuǎn)CRPC的進展,因此需要更多的研究去弄清這些治療藥物的耐藥機制,或者亟需更多新興的藥物研發(fā)以治療CRPC患者。值得注意的是,目前大部分研究都只關注腫瘤細胞本身,而對其賴以生存的周圍環(huán)境卻研究較少。但我們知道,腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開其周圍的環(huán)境�！胺N子土壤”學說指出,“種子”和它周圍的“土壤”共同構成了腫瘤發(fā)生發(fā)展的因素。因此,對于腫瘤來說,其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程都是與其周圍環(huán)境密不可分的,我們應該將腫瘤及其微環(huán)境作為一個整體進行研究,這樣也許就能解決目前的困境。腫瘤微環(huán)境中包括微血管、成纖維細胞、間質(zhì)細胞、免疫細胞等,還包括各種細胞分泌的細胞因子、趨化因子、化學因子等,它們共同形成了一個復雜的網(wǎng)絡,調(diào)控腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。而這其中,免疫細胞在腫瘤的進展過程中起了至關重要的作用。針對CTLA4或者PD1/PDL1的抗體已經(jīng)在包括腎癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌等多個腫瘤中證實有效。這說明針對腫瘤微環(huán)境進行靶向治療的策略切實可行。但是在前列腺癌中,傳統(tǒng)的免疫治療似乎對這兩種免疫檢查點抑制劑的效果并不明顯。因此就需要我們?nèi)�尋找耐藥機制,并進一步探索新的免疫治療方法。研究目的:本課題旨在探索晚期前列腺癌耐藥機制與周圍免疫微環(huán)境之間的關系和相互作用機制,主要分為以下三個部分:首先,從恩雜魯胺耐藥的晚期前列腺癌患者出發(fā),探索其周圍免疫微環(huán)境細胞,即腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)與腫瘤細胞之間的作用關系。其次,探索腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)與腫瘤細胞的具體作用機制。最后,將晚期前列腺癌患者與其周圍的免疫微環(huán)境作為一個整體進行研究,發(fā)現(xiàn)并比較CRPC進展過程中前列腺癌組織微環(huán)境中免疫細胞的整體分布情況,繪制免疫圖譜。對CRPC組織免疫細胞進行單細胞Bulk測序分析,發(fā)現(xiàn)其細胞內(nèi)的分子水平變化,尋找合適的干預靶點,設計小分子藥物和單克隆抗體,探索用于臨床治療的可能。研究方法:本課題前兩部分的研究,首先通過免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)了TAMs與晚期耐藥前列腺癌患者的關系,并驗證了140例臨床患者的基本資料,緊接著通過體外建立共培養(yǎng)細胞系,即單核巨噬細胞系與前列腺癌耐藥細胞系之間的共培養(yǎng)體系,研究TAM與前列腺腫瘤細胞之間的作用關系和機制。還通過Western Blot,qPCR,免疫共沉淀IP,染色質(zhì)免疫共沉淀CHIP等蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄組學的方法確定了兩者在轉(zhuǎn)錄層面和表達層面之間的分子變化。此外,我們用抗體芯片確定了TAMs分泌IL6來影響腫瘤細胞的耐藥機制,并用ELISA等實驗進行了驗證。除此之外,在確定關鍵的作用機制靶點之后,我們構建了免疫缺陷小鼠前列腺癌耐藥模型,在小鼠體內(nèi),針對幾個關鍵靶點的藥物以及治療手段進行試驗。在第三部分的研究中,我們對早期前列腺癌和晚期前列腺癌組織應用CyTOF技術,發(fā)現(xiàn)了其免疫微環(huán)境中各種免疫細胞的變化情況,并根據(jù)某些功能分子進行分群。針對其主要免疫反應的T細胞,我們將其分離提純,并進行了Bulk測序,發(fā)現(xiàn)了其轉(zhuǎn)錄組的詳細改變,由此發(fā)現(xiàn)了NRP1這個關鍵的免疫檢查點。并找到了它的作用配體,即腫瘤細胞分泌的SEMA3A,并通過一系列針對于T細胞的增殖、分泌實驗,在體外水平驗證了它能夠通過NRP1發(fā)揮抑制T細胞免疫反應的作用。研究結果:首先,我們通過免疫組化和體內(nèi)動物實驗的方法發(fā)現(xiàn)了,腫瘤周圍的TAMs與ADT誘導的前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分化呈正相關。并且這兩者的關系和患者臨床資料的預后、生化復發(fā)也有統(tǒng)計學上的相關意義。其次,我們通過建立共培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)了耐藥的前列腺癌細胞能夠募集并極化TAMs。更有趣的是,募集并極化的TAMs也能夠進一步導致前列腺癌細胞的耐藥和神經(jīng)內(nèi)分泌分化。緊接著,我們通過抗體芯片的方式找到了TAMs是通過分泌IL6/STAT3通路來影響腫瘤細胞的耐藥特性的。而具有恩雜魯胺耐藥特性的前列腺癌細胞則是通過擴增和分泌HMGB1來影響TAMs,即HMGB1不僅能夠穩(wěn)定腫瘤細胞內(nèi)β-catenin不被降解,使其順利入核激活下游神經(jīng)內(nèi)分泌相關基因轉(zhuǎn)錄,而且能夠分泌入細胞間隙,通過旁分泌的方式作用于單核巨噬細胞,募集并使其極化為TAMs,從而使TAMs又分泌更多的IL6去影響腫瘤細胞,由此形成了一個正反饋環(huán)路,導致前列腺癌細胞的耐藥性。接下來,我們構建了免疫缺陷小鼠前列腺癌耐藥模型,將針對幾個關鍵靶點的藥物即針對HMGB1和IL6R的藥物,將其應用于小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)不管是單用任何一種藥物,較安慰劑組相比,都能夠顯著改善其耐藥的特性,兩者聯(lián)合使用效果更佳。最后,我們將研究重點擴展到了整個晚期前列腺癌的免疫微環(huán)境,通過CyTOF技術發(fā)現(xiàn)晚期去勢抵抗性前列腺癌CRPC患者的免疫微環(huán)境較早期改變顯著,繪制了兩者的免疫圖譜差異,并詳細比較了包括CD4T細胞、CD8T細胞、Treg細胞、單核/巨噬細胞、B細胞、NK細胞、MDSC細胞、DC細胞等在內(nèi)的各種免疫細胞的改變差異,我們發(fā)現(xiàn)T細胞在免疫微環(huán)境中的改變尤其重要。因此我們將腫瘤組織中的T細胞進行了Bulk測序,找出了T細胞功能改變的關鍵分子NRP1,并通過一系列體外實驗發(fā)現(xiàn)了其作用配體SEMA3A,證實SEMA3A是通過作用于T細胞表面的NRP1最終導致T細胞增殖能力降低、分泌功能下降、發(fā)揮免疫功能的能力喪失,從而產(chǎn)生免疫逃逸的機制。研究結論:本研究從TAMs與晚期耐藥腫瘤細胞的互相作用關系著手,發(fā)現(xiàn)了腫瘤周圍免疫微環(huán)境對腫瘤細胞進展、耐藥的影響,并且發(fā)現(xiàn)了晚期前列腺癌中,其耐藥的細胞系通過HMGB1的自分泌與旁分泌功能募集、趨化單核巨噬細胞,TAMs形成后分泌IL6/STATA3通路反過來促進腫瘤細胞的耐藥的環(huán)路。除此之外,還將晚期前列腺癌與早期前列腺癌的的整個免疫微環(huán)境繪制出了一張清晰的圖譜,而且對比分析后發(fā)現(xiàn)了其中重要的抑制免疫反應的一條通路,為新的免疫治療策略奠定了扎實的基礎,為晚期耐藥前列腺癌患者提供了新的希望。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：

志物 NSE 和 CHGA 相比之下也偏高，如圖 1-1 C,D 及 1-2C,D 所示。除此之外，我們比較了 CRPC 組織中 CD163 表達量在陰性表達及高表達神經(jīng)內(nèi)分泌標志物中的差異，發(fā)現(xiàn)在 CRPC 中，CD163 在高表達 NE 標志物的組織里表達量較高，如圖 1-1 E,F 及 1-2 E,F 所示。因此，這些數(shù)據(jù)暗示在前列腺癌中TAMs 與 ADT 誘導的神經(jīng)內(nèi)分泌分化有正性相關的關系。

圖 1-2 前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌標志物在疾病不同狀態(tài)的差異統(tǒng)計分析表 1-1 經(jīng)過 ADT 治療后轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者的基本資料o. Aget-PSA(ng/ml)Metastatic site SVI PNIPre-GSMedication Post-GSDuratio(months1 70 151 lymph node, bone N Y 4+5=9LeuprorelinAcetate andBicalutamide4+5=9 42 57 76.1 bone N N 5+4=9 3+4=7 63 82 10.6 lymph node N N 5+5=10 5+5=10 144 67 88 lymph node, bone N N 5+4=9 5+4=9 5.55 81 1459 lymph node, bone N N 5+4=9 5+4=9 6除此之外，我們還檢測了 CD163 與 NSE 或者 CHGA 的這種共表達關系是否與前列腺癌患者的臨床預后有關。如圖 1-3 及表 1-2 及表 1-3 所示，共有 140 個患者被分成了四組，我們同時檢測了 CD163 與 NSE 或者 CHGA 它們的表達量之間的關系，發(fā)現(xiàn)兩者的共表達與預 Gleason 評分，腫瘤分期，膜侵襲狀態(tài)，手

圖 1-3 CD163 與 NSE 標志物跟前列腺癌臨床特征之間的關系除此之外，我們還在小鼠動物模型中驗證了這一結果。如圖 1-4 所示，我們將帶有熒光基團的 C4-2 細胞系注射進小鼠的前列腺中，第四周后對小鼠進行手術去勢，與此同時服用恩雜魯胺藥物，以后每周通過小動物活體成像儀檢測腫瘤體積變化以及血漿 PSA 水平。結果發(fā)現(xiàn)，最開始 PSA 水平是下降的，而且腫瘤的生長速度也變慢了，但是在晚期，PSA 水平和腫瘤的生長速度都升高了，這說明小鼠原位移植經(jīng)過長時間 ADT 治療后，恩雜魯胺耐藥了。而且，我們檢測了小鼠組織中 F4/80，NSE 以及 CHGA 的表達量，發(fā)現(xiàn)它們都比對照組的表達量升高。這些結果說明，ADT 誘導的神經(jīng)內(nèi)分泌分化不僅是前列腺癌 ADT 治療抗性的原因之一，同時它的發(fā)生也和 TAM 的浸潤密切相關。
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本文編號：2874598