發(fā)布時(shí)間：2020-11-03 03:13

　　 背景前列腺癌(Prostate cancer;PCa)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在男性癌癥相關(guān)死亡率中占第六位。據(jù)WHO全球腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,全球男性癌癥發(fā)病率排名,PCa僅次于肺癌位居第2位。在中國(guó),生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)西方化、人口老齡化使得PCa的發(fā)病率快速逐年上升。目前PCa臨床可行前列腺根治性切除術(shù);晚期以內(nèi)分泌治療為主,可行睪丸切除術(shù),配合激素阻斷治療。中位緩解期為18-24個(gè)月,多進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer;CRPC),具有高增殖性、高侵襲力,目前臨床治療方法多不理想。腫瘤細(xì)胞能夠?qū)�幾乎所有的靶點(diǎn)治療產(chǎn)生適應(yīng)性抵抗。這是在醫(yī)療領(lǐng)域中一直存在的挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)移性前列腺癌(Metastatic prostate cancer;mPCa)目前是無(wú)法治愈和致命的。自從1941年起由Huggins和Hodges進(jìn)行的外科或醫(yī)學(xué)閹割證明雄激素剝奪抑制前列腺癌,目前雄激素剝奪療法(androgen-deprivation therapy;ADT)仍然是mPCa治療的主要手段。ADT作用是限制雄激素的可用性和控制雄激素核異位。雄性激素受體(The androgen receptor,AR)調(diào)節(jié)劑作為一種轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與其配體結(jié)合域(LBD)結(jié)合,指導(dǎo)特異蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。盡管超過(guò)80%的mPCa患者最初對(duì)ADT有反應(yīng),但最終發(fā)展成CRPC。在這個(gè)階段,病人被考慮雄激素耗盡,因此PCa可能獨(dú)立于AR信號(hào)生長(zhǎng)。因此研究CRPC的發(fā)生機(jī)制并從中找到治療靶標(biāo)已成為目前研究CRPC的熱點(diǎn)。染色體不穩(wěn)定性是癌癥的標(biāo)志之一,與腫瘤轉(zhuǎn)移有著很大的相關(guān)性。SWI/SNF(Switch in mating type/sucrose non fermentation)復(fù)合物是染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的一種,由 BRG1/BRM,INI1(SMARCB1、BAF47、SNF5),BAF155,BAF170,BAF180和BAF250A亞基組成。染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF是發(fā)育基因表達(dá)的重要調(diào)控因子。SWI/SNF復(fù)合物在各種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中起重要作用,如細(xì)胞周期、腫瘤形成和細(xì)胞凋亡。SWI/SNF丟失誘發(fā)的癌癥發(fā)展,與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控和核小體定位有關(guān)。BRG1基因相關(guān)因子155(BRG1-associated factor 155,BAF155)是 SWI/SNF 復(fù)合物中的一員,BAF155是在細(xì)胞周期蛋白E復(fù)合物中被發(fā)現(xiàn)的,并能被其相關(guān)激酶磷酸化。由于BAF155位于染色體3p221.31上,其中包括一些腫瘤抑制基因,如FUS1和SEM3B,因此BAF155的缺失可能有助于腫瘤的發(fā)展,但BAF155在人類前列腺癌PC3細(xì)胞中的功能尚未得到完全明確。Med19是Mediator家族的重要成員,在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要功能,敲除Med19亞基使Mediator復(fù)合物的穩(wěn)定性降低,抑制RNA聚合酶Ⅱ末端磷酸化,從而使轉(zhuǎn)錄水平的降低,因此沉默其表達(dá)能抑制腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散。已有研究表明,中介體復(fù)合物亞基19(Mediator Complex Subunit 19;Med 19)參與了多種腫瘤的進(jìn)展過(guò)程,過(guò)度表達(dá)起促進(jìn)作用。Med19通過(guò)調(diào)節(jié)CBFA2T3/HEB的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。Med19能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖遷移能力同時(shí)還可增強(qiáng)化療藥物Cisplatin的敏感性。Med19被miR-101-3p/miR-422a靶向,通過(guò)調(diào)控EGFR/MEK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展,下調(diào)HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)阿霉素的化學(xué)敏感性。癌細(xì)胞浸潤(rùn)前沿的腫瘤-宿主相互作用是一個(gè)重要的界面,它包含了癌細(xì)胞去分化的動(dòng)態(tài)過(guò)程,稱為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mysenchymal transition;EMT)。EMT 可以通過(guò)“腫瘤萌芽”形式進(jìn)行組織學(xué)鑒定,這一特征對(duì)于顯示浸潤(rùn)性腫瘤生長(zhǎng)模式的腫瘤具有高度的特異性。重要的是,腫瘤萌芽和腫瘤邊界形態(tài)作為額外的預(yù)后因素引起了人們的極大興趣,并且也被國(guó)際抗癌聯(lián)盟所認(rèn)可。腫瘤轉(zhuǎn)移起初需要細(xì)胞侵襲,而侵襲是由EMT啟動(dòng)的。然而,Med19在前列腺癌中的作用尚不明確,因此本研究試圖闡明Med19在前列腺癌中,是如何調(diào)控EMT啟動(dòng)調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞增殖遷移以及凋亡作用的。本文主要進(jìn)行BAF155和Med19在人前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用及分子機(jī)制研究:1、為了探討在前列腺癌細(xì)胞中增殖、分化與轉(zhuǎn)移中BAF155發(fā)揮的作用,本研究利用蛋白質(zhì)印跡法分析了 BAF155蛋白在PC3中表達(dá)水平;2、在PC3、Hela和SNUC2B細(xì)胞篩選BAF155蛋白表達(dá)水平較高的細(xì)胞系,使用慢病毒BAF155-shRNA和BAF155-siRNA分別對(duì)BAF155基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾,檢測(cè)BAF155mRNA和蛋白表達(dá)情況以及細(xì)胞系的增殖情況、侵襲能力和細(xì)胞凋亡,驗(yàn)證前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為是否受BAF155的調(diào)控,為前列腺癌形成的分子機(jī)制和后續(xù)治療的研究奠定基礎(chǔ);3、在PC3細(xì)胞中,研究敲除Med19-siRNA后細(xì)胞敲除效率,Medl9如何調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖遷移作用,Med19是如何影響EMT啟動(dòng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖遷移作用。研究?jī)?nèi)容分為以下兩大部分:第一部分BAF155在人類前列腺癌PC3細(xì)胞中的功能的研究研究目的本研究探討在人類PC3細(xì)胞中BAF155的作用,并進(jìn)一步解釋BAF155表達(dá)缺失的作用機(jī)制。從而為低分化、非雄激素依賴的前列腺癌的治療尋找更好的治療靶點(diǎn)。研究方法1.用免疫印跡方法檢測(cè)BAF155在PC3細(xì)胞中表達(dá)情況。2.將野生型BAF155的全長(zhǎng)編碼序列亞克隆至載體pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建BAF155(pc-BAF155)的超表達(dá)載體,并進(jìn)行測(cè)序鑒定。3.將 pcDNA3.1、pc-BAF155、pc-BAF155+si-BAF155 分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。利用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,QRT-PCR)檢測(cè)BAF155的mRNA表達(dá)水平,并用免疫印跡檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染BAF155蛋白效率。4.將上述轉(zhuǎn)染BAF155因子的PC3細(xì)胞分別用MTT法,凋亡檢測(cè)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力,凋亡和遷移能力。5.最后用Western blot檢測(cè)p16和磷脂酰肌醇-3-羥激酶(Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3 K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,AKT)和 WNT/β-catenin通路涉及的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。6.數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),在Hela細(xì)胞中BAF155高表達(dá),BRG1低表達(dá);在PC3細(xì)胞中BAF155表達(dá)缺失和BRG1低表達(dá);SNUC2B細(xì)胞BRG1高表達(dá),但BAF155不表達(dá)。2.在PC3細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)BAF155能夠增加BAF155轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)表達(dá),但是敲除BAF155后,BAF155表達(dá)下降。3.過(guò)表達(dá)BAF155明顯抑制PC3細(xì)胞的增殖(抑制率為50%)和遷移能力(遷移率抑制率56%),并促進(jìn)PC3細(xì)胞的凋亡(凋亡率28%)(P0.05),再向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-BAF155后,細(xì)胞的遷移能力又出現(xiàn)增加。4.對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步研究表明,細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pc-BAF155后p16的表達(dá)水平顯著增加(增長(zhǎng)倍數(shù)為2.3)(P0.05),過(guò)表達(dá)BAF155能夠顯著抑制p/t-PI3K、p/t-AKT、Wnt3a、β-catenin 和 Wnt5a 的表達(dá)水平(P0.05)(抑制倍數(shù)分別為0.78、0.45、0.67、0.63、0.52),從而抑制PC3細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡。當(dāng)再向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-BAF155后,這些蛋白的表達(dá)水平又恢復(fù)到正常。研究結(jié)論在PC3細(xì)胞中BAF155具有抑癌作用。BAF155可抑制PC3細(xì)胞的增殖和遷移能力,抑制后PC3細(xì)胞又重新具有增殖遷移能力。BAF155通過(guò)上調(diào)p16的表達(dá),下調(diào)PI3K/AKT水平,并使WNT/β-catenin通路失活,最終誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示BAF155可以作為一個(gè)有效靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。研究意義本研究首次研究BAF155在前列腺癌細(xì)胞中抑癌作用,并發(fā)現(xiàn)在PC3細(xì)胞中,BAF155可以上調(diào)p16,下調(diào)PI3K/AKT水平,并使WNT/β-catenin通路失活,最終誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡。第二部分沉默人類前列腺癌PC3細(xì)胞中的Med19基因的基礎(chǔ)研究研究目的探討Med19對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲遷移能力的影響及其在EMT轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用機(jī)制。研究方法1.采用針對(duì)Med 19的siRNA慢病毒載體感染PC3細(xì)胞。2.應(yīng)用QRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡方法(Western blot,WB)檢測(cè)Med 19-siRNA感染組小干擾 RNA(Small interfering RNA,siRNA)與空載組(scRNA)Medl9 基因轉(zhuǎn)錄翻譯情況。3.采用Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染后PC3細(xì)胞侵襲、遷移能力變化。4.采用 QRT-PCR 檢測(cè)感染后 PC3 細(xì)胞 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、ZEB2、Snail-1 和 Snail-2 mRNA 的表達(dá)。研究結(jié)果1.PC3-Med19-si/sc細(xì)胞的建立與表征。在慢病毒感染和FACS分類后,通過(guò)熒光顯微鏡下測(cè)定GFP的表達(dá)來(lái)證實(shí)其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。所有細(xì)胞的GFP 陽(yáng)性率均大于95%。2.Med 19-siRNA慢病毒感染PC3細(xì)胞后,實(shí)驗(yàn)組Med 19 mRNA表達(dá)水平比空載組明顯降低(基因轉(zhuǎn)錄率低18%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)3.Med 19-siRNA慢病毒感染Med19蛋白表達(dá)水平比空載組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示感染組細(xì)胞侵襲、遷移能力明顯減弱(P0.01)。PC3-Med 19-si 細(xì)胞侵襲率為19.71 ±4.00%,而對(duì)照 PC3-Med 19-sc細(xì)胞的侵襲率為32.27±3.72%(*P0.05)。PC3-Med 19-si細(xì)胞劃痕修復(fù)區(qū)域比率顯著小于對(duì)照細(xì)胞(70.83 ±9.37%v.s.87.33±4.63%,**P0.01)。5.感染組 N-Cadherin、Vimentin、ZEB2、Snail-1 和 Snail-2 表達(dá)降低,E-Cadherin表達(dá)升高,在PC3-Med19-sc組和PC3-Med19-si組相比下面蛋白相對(duì)灰度均值:N-Cadherin:1±0.12756、0.45586±0.05091;E-Cadherin:1±0.07178、1.78180±0.14847;Vimentin:1±0.07177、0.46652士0.03348;ZEB2:1±0.04083、0.43528±0.04862;Snail-1:1±0.12756、0.58777±0.02400;Snail-2:1±0.04830、0.57435±0.04786。因素方差分析結(jié)果顯示p0.05。研究結(jié)論沉默Med 19基因可通過(guò)抑制EMT中的相關(guān)基因從而降低人前列腺癌PC3細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。研究創(chuàng)新性通過(guò)本研究首次報(bào)道Med19抑制EMT及相關(guān)基因的表達(dá),從而前列腺癌細(xì)胞增殖遷移能力得到抑制。揭示了 Med19在前列腺癌中重要作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號(hào)說(shuō)明（按字母順序排列）
第一部分 BAF155在人類前列腺癌PC3細(xì)胞中的功能的研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附錄
第二部分 沉默人類前列腺癌PC3細(xì)胞中的Med19基因的基礎(chǔ)研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附錄
參考文獻(xiàn)
綜述 綜合評(píng)估晚期前列腺癌患者治療靶點(diǎn)
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和參加科研情況
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表
English paper （Ⅰ）
English paper （Ⅱ）

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本文編號(hào)：2868013