發(fā)布時間：2020-10-31 00:46

　　 研究背景:越來越多的研究表明,miRNAs是多種腫瘤重要的轉錄后調節(jié)因子,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉移過程中起著重要的作用。據報道,miR-543通過促進前列腺癌的生長在前列腺癌中扮演著促癌基因的角色,然而miR-543調控前列腺癌細胞的增殖、轉移和干性特性的研究以及其具體機制尚未被闡述。研究目的:探討miR-543促進前列腺癌細胞增殖、轉移以及干性特征的相關分子機制,從而探討前列腺癌復發(fā)轉移的相關分子生物學機制,期待為前列腺癌新的治療手段提供堅實的理論基礎。研究方法:本實驗采用熒光定量PCR檢測前列腺癌CD44~+PC3、CD44~-PC3、CD44~+Du145、CD44~-Du145細胞中miR-543的表達水平。分別向DU145和PC3細胞系轉染miR-543的模擬劑、抑制劑后,采用熒光定量PCR檢測miR-543、Numb以及干細胞相關的標記分子的表達情況;Transwell侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力;克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力;利用干細胞懸浮成球和3-D matrigel成球實驗技術檢測前列腺癌干細胞相關特性;以及利用Western Blot檢測干細胞相關蛋白的表達。在CD44~+前列腺癌細胞中過表達Numb或者在CD44~-前列腺癌細胞中敲低Numb后,采用平板克隆、懸浮成球、Transwell技術分別檢測細胞的增殖、自我更新、遷移以及侵襲能力。生物信息學和雙螢光素酶報告實驗分別用來預測和驗證Numb是否為miR-543的靶基因。同時,我們還構建含全部Numb cDNA序列但不含有Numb 3’UTR全部序列的過表達質粒,在PC3細胞中共轉染Numb和miR-543。將轉染miR-543后的PC3細胞系接種于免疫缺陷性小鼠皮下和尾靜脈,觀察小鼠皮下成瘤能力和尾靜脈肺轉移的情況。研究結果:CD44~+PC3和CD44~+Du145細胞miR543表達水平分別高于CD44~-PC3和CD44~-Du145細胞。前列腺癌細胞內轉染模擬劑后miR-543表達明顯高于對照組,而Numb的表達水平均低于對照組,miR-543過表達組細胞的侵襲、克隆形成、干細胞懸浮成球以及細胞貼壁非依耐性生長的能力高于對照組。轉染抑制劑的前列腺癌細胞miR-543表達水平明顯低于對照組,Numb的表達水平高于對照組,并且細胞侵襲能力、克隆形成能力、干細胞懸浮成球以及細胞貼壁非依耐性生長的能力明顯下降。Western Blot結果顯示miR-543過表達則Numb表達下調,miRNA敲低則Numb過表達,兩者表達情況剛好相反。在CD44~-PC3細胞內敲低Numb后,細胞的侵襲能力、貼壁非依賴性生長以及干細胞懸浮成球能力均增加,在CD44~+PC3細胞中過表達Numb后,則出現相反的結果。雙熒光素酶基因報告實驗結果顯示miR-543可抑制野生型Numb 3’UTR報告基因載體的熒光素酶活性,而對突變型Numb 3’UTR的熒光素酶活性無影響,該結果與我們軟件預測miR-543的靶基因的結果一致。PC3細胞共轉染不含3’UTR的Numb過表達質粒和miR-543 mimic后,實驗結果顯示Numb過表達能夠逆轉miR-543的促癌作用。miR-543過表達后小鼠皮下成瘤體積明顯增大,miR-543敲低則抑制小鼠皮下成瘤的大小。miR-543過表達后小鼠的肺轉移能力也增強。研究結論:miR-543通過直接抑制Numb基因,正向的調控前列腺癌細胞增殖、轉移以及干性特性,從而促進腫瘤的發(fā)生和轉移,miR-543有望成為治療前列腺癌轉移的潛在靶點。
【學位單位】：長江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：

CD44+和 CD44-前列腺癌細胞中的表達差異。流式細胞分選 DU145 細胞，熒光定量 PCR 分別檢測 CD44+PC3、DU145胞 miR-543 的表達。（**P<0.01）n of the expression of miR-543 in CD44+and CD44-prostate c were separated by flow cytometry. Fluorescence quantitative ssion of miR543 in CD44+prostate cancer cells and CD44-pr*P<0.01）1.4 討論 30%的基因組能被轉錄，只有 1%的基因能編碼蛋白因大部分轉錄后被稱為非編碼 RNA，其中 miRNA ，目前被發(fā)現的 miRNA 基因有成百上千種，它們參過程。近些年，miRNA 被發(fā)現在某些腫瘤內異常表癌基因的角色。但是目前大部分 miRNA 在癌癥中發(fā)清楚或者并不完善。前面有人已經研究過 miR-543

陰性對照組前列腺癌細胞的克隆形成、細胞侵襲、貼壁非依耐性生長和懸浮成球能力的差異。當 P< 0.05 時認為差異具有統(tǒng)計學意義。2.3 結果2.3.1 miR-543 的模擬劑和抑制劑轉染效率驗證miR-543 mimic 和 inhibitor 是體內成熟的 miR-543 模擬物和抑制劑，可以模擬和抑制 miR-543 的生物學功能。Lipofactamine RNAiMAX 轉染試劑的轉染效率高。我們利用 LipofectamineRNAiMAX 轉染試劑將 miR-543mimic、mimic-nc、inhibitor 和 inhibitor-nc 轉染至 PC3 和 DU145 前列腺癌細胞株。48 小時后熒光定量 PCR 驗證轉染效率。轉染 miR-543mimic 組的 PC3 細胞 miR-543 表達情況是對照組的 42.76±5.708 倍，轉染 mimic 組的 DU145 細胞 miR-543 表達情況是對照組的 83.94±9.7 倍。轉染 inhibitor543 組的 PC3 細胞 miR-543 表達情況是對照組的0.04667±0.004 倍，轉染 inhibitor 543 組的 DU145 細胞 miR-543 表達情況是對照組的 0.0356±0.004 倍。差異均具有統(tǒng)計學意義。證明 miR-543 過表達和敲低體系構建成功。

48 小時后分別檢測穿過上室的細胞，從而比較前列腺癌不同組細胞的侵襲能力。結果顯示，過表達 miR-543 后，PC3 和 DU145 細胞侵襲能力比對照組侵襲能力增強（P=0.0107，P=0.0134），敲低 miR-543 后，PC3 和 DU145 細胞侵襲能受到抑制（P=0.0236，P=0.0219），差異均具有統(tǒng)計學意義。說明 miR-543 過表達促進前列腺癌激素非依耐性細胞（PC3、DU145 細胞）的侵襲轉移。大量研究顯示，腫瘤的啟動和發(fā)展與 EMT 密切相關[37]，EMT 是一些癌癥轉移的關鍵調節(jié)因子，具有侵襲性表型。在促進轉移的同時，EMT 過程被認為能產生腫瘤干細胞，并且 EMT 與腫瘤的治療抵抗密切相關[38]。于是我們猜想 miR-543 促進前列腺癌細胞的侵襲是否與 EMT 相關，因為 EMT 也是腫瘤細胞維持干性特征的因素之一。利用 WB 檢測 miR-543 過表達后 EMT 相關分子的表達情況。實驗結果顯示，miR-543 過表達的 PC3 和 DU145 細胞比對照組的上皮表型E-cadherin 分子表達明顯降低，miR-543 過表達的 PC3 和 DU145 細胞比對照組的間質表型 Vimentin 分子表達明顯增加。說明 miR-543 促進前列腺癌細胞的侵襲能力歸因于或者至少部分歸因于 miR-543 參與 EMT 的調控，EMT 與腫瘤干細胞的干性是密切相關。
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本文編號：2863230