發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 00:46

　　 研究背景:越來越多的研究表明,miRNAs是多種腫瘤重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。據(jù)報(bào)道,miR-543通過促進(jìn)前列腺癌的生長在前列腺癌中扮演著促癌基因的角色,然而miR-543調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和干性特性的研究以及其具體機(jī)制尚未被闡述。研究目的:探討miR-543促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及干性特征的相關(guān)分子機(jī)制,從而探討前列腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制,期待為前列腺癌新的治療手段提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。研究方法:本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR檢測(cè)前列腺癌CD44~+PC3、CD44~-PC3、CD44~+Du145、CD44~-Du145細(xì)胞中miR-543的表達(dá)水平。分別向DU145和PC3細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-543的模擬劑、抑制劑后,采用熒光定量PCR檢測(cè)miR-543、Numb以及干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記分子的表達(dá)情況;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;利用干細(xì)胞懸浮成球和3-D matrigel成球?qū)嶒?yàn)技術(shù)檢測(cè)前列腺癌干細(xì)胞相關(guān)特性;以及利用Western Blot檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)。在CD44~+前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)Numb或者在CD44~-前列腺癌細(xì)胞中敲低Numb后,采用平板克隆、懸浮成球、Transwell技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖、自我更新、遷移以及侵襲能力。生物信息學(xué)和雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分別用來預(yù)測(cè)和驗(yàn)證Numb是否為miR-543的靶基因。同時(shí),我們還構(gòu)建含全部Numb cDNA序列但不含有Numb 3’UTR全部序列的過表達(dá)質(zhì)粒,在PC3細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Numb和miR-543。將轉(zhuǎn)染miR-543后的PC3細(xì)胞系接種于免疫缺陷性小鼠皮下和尾靜脈,觀察小鼠皮下成瘤能力和尾靜脈肺轉(zhuǎn)移的情況。研究結(jié)果:CD44~+PC3和CD44~+Du145細(xì)胞miR543表達(dá)水平分別高于CD44~-PC3和CD44~-Du145細(xì)胞。前列腺癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染模擬劑后miR-543表達(dá)明顯高于對(duì)照組,而Numb的表達(dá)水平均低于對(duì)照組,miR-543過表達(dá)組細(xì)胞的侵襲、克隆形成、干細(xì)胞懸浮成球以及細(xì)胞貼壁非依耐性生長的能力高于對(duì)照組。轉(zhuǎn)染抑制劑的前列腺癌細(xì)胞miR-543表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,Numb的表達(dá)水平高于對(duì)照組,并且細(xì)胞侵襲能力、克隆形成能力、干細(xì)胞懸浮成球以及細(xì)胞貼壁非依耐性生長的能力明顯下降。Western Blot結(jié)果顯示miR-543過表達(dá)則Numb表達(dá)下調(diào),miRNA敲低則Numb過表達(dá),兩者表達(dá)情況剛好相反。在CD44~-PC3細(xì)胞內(nèi)敲低Numb后,細(xì)胞的侵襲能力、貼壁非依賴性生長以及干細(xì)胞懸浮成球能力均增加,在CD44~+PC3細(xì)胞中過表達(dá)Numb后,則出現(xiàn)相反的結(jié)果。雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-543可抑制野生型Numb 3’UTR報(bào)告基因載體的熒光素酶活性,而對(duì)突變型Numb 3’UTR的熒光素酶活性無影響,該結(jié)果與我們軟件預(yù)測(cè)miR-543的靶基因的結(jié)果一致。PC3細(xì)胞共轉(zhuǎn)染不含3’UTR的Numb過表達(dá)質(zhì)粒和miR-543 mimic后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Numb過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-543的促癌作用。miR-543過表達(dá)后小鼠皮下成瘤體積明顯增大,miR-543敲低則抑制小鼠皮下成瘤的大小。miR-543過表達(dá)后小鼠的肺轉(zhuǎn)移能力也增強(qiáng)。研究結(jié)論:miR-543通過直接抑制Numb基因,正向的調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及干性特性,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,miR-543有望成為治療前列腺癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【部分圖文】：

CD44+和 CD44-前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。流式細(xì)胞分選 DU145 細(xì)胞，熒光定量 PCR 分別檢測(cè) CD44+PC3、DU145胞 miR-543 的表達(dá)。（**P<0.01）n of the expression of miR-543 in CD44+and CD44-prostate c were separated by flow cytometry. Fluorescence quantitative ssion of miR543 in CD44+prostate cancer cells and CD44-pr*P<0.01）1.4 討論 30%的基因組能被轉(zhuǎn)錄，只有 1%的基因能編碼蛋白因大部分轉(zhuǎn)錄后被稱為非編碼 RNA，其中 miRNA ，目前被發(fā)現(xiàn)的 miRNA 基因有成百上千種，它們參過程。近些年，miRNA 被發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤內(nèi)異常表癌基因的角色。但是目前大部分 miRNA 在癌癥中發(fā)清楚或者并不完善。前面有人已經(jīng)研究過 miR-543

陰性對(duì)照組前列腺癌細(xì)胞的克隆形成、細(xì)胞侵襲、貼壁非依耐性生長和懸浮成球能力的差異。當(dāng) P< 0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3 結(jié)果2.3.1 miR-543 的模擬劑和抑制劑轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證miR-543 mimic 和 inhibitor 是體內(nèi)成熟的 miR-543 模擬物和抑制劑，可以模擬和抑制 miR-543 的生物學(xué)功能。Lipofactamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率高。我們利用 LipofectamineRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑將 miR-543mimic、mimic-nc、inhibitor 和 inhibitor-nc 轉(zhuǎn)染至 PC3 和 DU145 前列腺癌細(xì)胞株。48 小時(shí)后熒光定量 PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染 miR-543mimic 組的 PC3 細(xì)胞 miR-543 表達(dá)情況是對(duì)照組的 42.76±5.708 倍，轉(zhuǎn)染 mimic 組的 DU145 細(xì)胞 miR-543 表達(dá)情況是對(duì)照組的 83.94±9.7 倍。轉(zhuǎn)染 inhibitor543 組的 PC3 細(xì)胞 miR-543 表達(dá)情況是對(duì)照組的0.04667±0.004 倍，轉(zhuǎn)染 inhibitor 543 組的 DU145 細(xì)胞 miR-543 表達(dá)情況是對(duì)照組的 0.0356±0.004 倍。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明 miR-543 過表達(dá)和敲低體系構(gòu)建成功。

48 小時(shí)后分別檢測(cè)穿過上室的細(xì)胞，從而比較前列腺癌不同組細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，過表達(dá) miR-543 后，PC3 和 DU145 細(xì)胞侵襲能力比對(duì)照組侵襲能力增強(qiáng)（P=0.0107，P=0.0134），敲低 miR-543 后，PC3 和 DU145 細(xì)胞侵襲能受到抑制（P=0.0236，P=0.0219），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明 miR-543 過表達(dá)促進(jìn)前列腺癌激素非依耐性細(xì)胞（PC3、DU145 細(xì)胞）的侵襲轉(zhuǎn)移。大量研究顯示，腫瘤的啟動(dòng)和發(fā)展與 EMT 密切相關(guān)[37]，EMT 是一些癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有侵襲性表型。在促進(jìn)轉(zhuǎn)移的同時(shí)，EMT 過程被認(rèn)為能產(chǎn)生腫瘤干細(xì)胞，并且 EMT 與腫瘤的治療抵抗密切相關(guān)[38]。于是我們猜想 miR-543 促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲是否與 EMT 相關(guān)，因?yàn)?EMT 也是腫瘤細(xì)胞維持干性特征的因素之一。利用 WB 檢測(cè) miR-543 過表達(dá)后 EMT 相關(guān)分子的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-543 過表達(dá)的 PC3 和 DU145 細(xì)胞比對(duì)照組的上皮表型E-cadherin 分子表達(dá)明顯降低，miR-543 過表達(dá)的 PC3 和 DU145 細(xì)胞比對(duì)照組的間質(zhì)表型 Vimentin 分子表達(dá)明顯增加。說明 miR-543 促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力歸因于或者至少部分歸因于 miR-543 參與 EMT 的調(diào)控，EMT 與腫瘤干細(xì)胞的干性是密切相關(guān)。
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本文編號(hào)：2863230