發(fā)布時間：2020-10-30 14:16

　　 目的:分析不同惡性程度膀胱癌組織中RAB14的表達(dá)水平,并探究其表達(dá)水平與膀胱癌臨床分期、分化程度、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理因素之間的相關(guān)性。采用基因芯片高通量篩選RAB14表達(dá)干擾后膀胱癌細(xì)胞的基因表達(dá)變化,預(yù)測RAB14下游的關(guān)鍵互作基因及分子機(jī)制。通過免疫組化和western blot等方法檢測及驗證RAB14表達(dá)下調(diào)后其下游關(guān)鍵基因及分子的蛋白翻譯水平變化,探究RAB14在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制。方法:收集2013年1月至2018年12月于我院行全膀胱根治性術(shù)的膀胱癌組織標(biāo)本80例及正常膀胱組織30例;采用免疫組化法檢測RAB14在膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達(dá),分析其表達(dá)水平與胱癌臨床分期、分化程度、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理因素之間的關(guān)系;體外培養(yǎng)不同的膀胱癌細(xì)胞株,采用qRT-PCR檢測RAB14基因在各細(xì)胞中的表達(dá)水平,分析其表達(dá)差異。采用慢病毒技術(shù)構(gòu)建RAB14表達(dá)干擾的細(xì)胞模型,采用高通量基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選RAB14表達(dá)變化后膀胱癌細(xì)胞中基因表達(dá)的變化,預(yù)測RAB14的下游關(guān)鍵互作基因及分子機(jī)制。通過免疫組化法檢測上述基因芯片高通量篩選的MAPK通路相關(guān)蛋白MAPK1的表達(dá),分析其表達(dá)與RAB14的相關(guān)性;在構(gòu)建RAB14干擾的細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,采用Western blot檢測RAB14表達(dá)改變對MAPK通路相關(guān)蛋白MAPK1、MAPK8、DUSP6、FOS及SHC1的表達(dá)的影響。結(jié)果:1.膀胱癌組織中RAB14基因的表達(dá)水平要高于正常的膀胱黏膜,差異顯著(P=0.0128),且侵襲性膀胱癌組織中RAB14的表達(dá)水平要明顯高于非侵襲性膀胱癌組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);RAB14表達(dá)水平與膀胱癌的有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)、臨床TNM分期(P=0.009)、腫瘤細(xì)胞分化程度(P=0.000)呈正相關(guān)。qRT-PCR檢測結(jié)果表明,與J82低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞相比,RAB14在高轉(zhuǎn)移潛能的膀胱癌細(xì)胞株5637和T24中的表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。2.qRT-PCR檢測KD組RAB14基因敲減效率相比NC組達(dá)到53.3%,RAB14敲減效果佳。PCA分析KD組和NC組之間差異較大,提示樣本質(zhì)量較好。基因芯片結(jié)果顯示RAB14表達(dá)下調(diào)后,膀胱癌細(xì)胞5637中表達(dá)上調(diào)的基因共有498個,表達(dá)下調(diào)的基因有551個,GO富集分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)途徑(Biological process)主要富集在細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控及細(xì)胞遷移上;細(xì)胞內(nèi)組分(Cellular components)主要富集在胞外外泌體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)中;分子功能(Molecular function)主要體現(xiàn)在具有調(diào)節(jié)GTP酶活性、與蛋白質(zhì)結(jié)合、與表皮生長因子受體結(jié)合及具有激酶活性等生物學(xué)功能。KEGG通路分析顯示其差異表達(dá)基因主要富集在MAPK signaling pathway、Pathways in cancer、Pertussis、FoxO signaling pathway等信號通路上。3.免疫組化結(jié)果表明膀胱癌組織中MAPK1染色呈強(qiáng)陽性,其表達(dá)趨勢與RAB14表達(dá)趨勢正相關(guān),即在癌組織中RAB14低表達(dá)時,MAPK1表達(dá)強(qiáng)度亦偏弱,在RAB14高表達(dá)的膀胱癌組織中MAPK1的表達(dá)強(qiáng)度則偏強(qiáng);Western blot結(jié)果表明RAB14表達(dá)被干擾后,膀胱癌細(xì)胞中MAPK1和MAPK8的蛋白表達(dá)水平明顯降低,而DUSP6,FOS及SHC1的蛋白表達(dá)水平則明顯升高。結(jié)論:1.RAB14是一個與膀胱癌關(guān)系密切的基因,其在其癌組織及癌細(xì)胞中呈較高表達(dá)水平,且其表達(dá)水平與膀胱癌臨床分期、腫瘤細(xì)胞分化程度及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理因素呈正相關(guān);2.基因芯片高通量數(shù)據(jù)顯示,RAB14干擾表達(dá)后,影響多個基因的表達(dá)改變和多條信號通路傳導(dǎo)被激活或被抑制,其中ERK/MAPK信號通路被顯著抑制;3.RAB14通過上調(diào)MAPK1和MAPK8的表達(dá)并下調(diào)DUSP6、FOS和SHC1的表達(dá),從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的進(jìn)展。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

第 2 章 免疫組化及 qPCR 技術(shù)檢測膀胱癌組織及細(xì)胞中 RAB14 的表達(dá)StainingindexofRAB1401 02 03 0N o rm a l C a n c e r*P = 0 .0 1 2 8圖 1-1. 分析不同的膀胱癌組織中及正常組織中 RAB14 蛋白的表達(dá)情況

圖 1-3. 分析不同惡性程度的膀胱癌細(xì)胞中 RAB14 基因的表達(dá)差異ab 蛋白屬于小 GTP 酶蛋白質(zhì)超家族的一員，其分子質(zhì)量約為 20~3功能是參與調(diào)控細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)哪遗菪纬�、囊泡形成轉(zhuǎn)運(yùn)及膜的融學(xué)過程[33]。研究發(fā)現(xiàn) Rab 蛋白家族與腫瘤關(guān)系密切，其可調(diào)控腫質(zhì)傳遞和信號轉(zhuǎn)運(yùn)，在腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過鍵調(diào)控因子的角色[34]。Gong 等[35]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，RAB18 在肝癌中異常高表達(dá)，癌組織中 RAB18 高表達(dá)的患者總體生存率低，R患者生存率相對較高，即 RAB18 越高，肝癌患者預(yù)后越差；體外過干擾肝癌細(xì)胞 RAB18 的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的克隆形成、增殖率遷移及侵襲能力明顯減弱。提示 RAB18 基因表達(dá)與肝癌患者的預(yù)其表達(dá)水平高則患者預(yù)后不良，并可提高肝癌細(xì)胞的增殖率和促快了肝癌進(jìn)展。Liu 等[36]學(xué)者報道，采用轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)乳腺癌細(xì)胞A-MB-231 中 RAB9 表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率明顯下降，細(xì)胞的存活延

第 3 章 基因芯片技術(shù)分析 RAB14 干擾后下游基因表達(dá)譜的改變及對相關(guān)信號通路的影響2 結(jié)果2.1 膀胱癌細(xì)胞 5637 慢病毒轉(zhuǎn)染效率及 qRT-PCR 驗證通過采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾 5637 細(xì)胞中 RAB14 的表達(dá)，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)NC組與KD組轉(zhuǎn)染效果達(dá)90%以上，轉(zhuǎn)染效果好（圖2-1A）；進(jìn)一步qRT-PCR驗證 RAB14 干擾慢病毒轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 NC 組相比，KD 組中 RAB14基因敲減效率達(dá)到 53.3%，說明 RAB14 敲減效果佳，符合預(yù)期（圖 2-1B）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2862593