發(fā)布時間：2018-08-28 18:34

【摘要】：研究背景與研究目的糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是終末期腎臟病的一個主要病因,其發(fā)病率及病死率逐年增加。即使經(jīng)過嚴(yán)格的血糖和血壓控制,仍有許多糖尿病病人出現(xiàn)DN的并發(fā)癥。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,至今仍未完全明了,因此探究DN的發(fā)病機(jī)制以及尋找早期可以防治DN的藥物是十分有必要的。以前人們認(rèn)為糖尿病腎病是一種非免疫性疾病,但現(xiàn)在很多研究表明固有免疫系統(tǒng)和炎癥機(jī)制的激活在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及防治過程中起著非常重要的作用。近年來,關(guān)于Toll樣受體在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用受到廣泛關(guān)注。Toll樣受體是一種模式識別受體,能激活固有免疫系統(tǒng),導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子和化學(xué)因子的產(chǎn)生。已有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病狀態(tài)下,Toll樣受體能敏感的感知高糖等危險信號,隨后介導(dǎo)炎癥反應(yīng),促進(jìn)疾病進(jìn)展。許多研究表明,Toll樣受體4(toll-like receptor4, TLR4)在腎小球腎炎、腎臟缺血再灌注、DN等很多腎臟疾病中起著重要的作用。足細(xì)胞是一種具有高度分化的腎小球血管上皮細(xì)胞,參與形成腎小球?yàn)V過屏障。研究表明足細(xì)胞損傷導(dǎo)致腎小球的濾過屏障受損,形成大量蛋白尿,最終導(dǎo)致腎小球硬化。許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)DN中存在足細(xì)胞密度減少、足細(xì)胞受損,足細(xì)胞受損情況成為預(yù)測DN進(jìn)展的主要指標(biāo)之一。在很多損傷因素的刺激下足細(xì)胞可以發(fā)生一連串的適應(yīng)性改變。但如果這種損傷因素變?yōu)槁�性進(jìn)展性的刺激,足細(xì)胞除了發(fā)生凋亡還會導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)。EMT使足細(xì)胞表型發(fā)生改變,使其上皮特異性指標(biāo)丟失,而增加其間質(zhì)表型的指標(biāo)。近年來,有研究指出足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化可能參與DN的發(fā)生發(fā)展。小凹蛋白1 (caveolin-1, cav-1)是小凹(caveolae)的主要結(jié)構(gòu)和功能成分,保持caveolae的Ω形態(tài),存在于多種細(xì)胞膜。Caveolae能為許多信號分子之間的相互作用提供了作用的平臺,也可以調(diào)節(jié)多個信號通路的活性。P-cav-1在特異性刺激狀態(tài)下可與其他蛋白相互作用而發(fā)揮其功能。近年來許多研究證實(shí)了cav-1在調(diào)節(jié)固有免疫和炎癥反應(yīng)中具有重要作用。有報(bào)道cav-1通過直接與TLR4結(jié)合發(fā)揮其抗炎效果,還有研究發(fā)現(xiàn)p-cav-1可激活TLR4信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然而,cav-1或者p-cav-1是否會影響足細(xì)胞中TLR4激活目前還沒有研究。許多研究還發(fā)現(xiàn)cav-1可以與上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)結(jié)合在一起,并與p-鏈蛋白(β-catenin)相互作用。Cav-1可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間的連接功能,而cav-1與β-catenin的相互作用成為DN足細(xì)胞發(fā)生的EMT改變的新的機(jī)制。姜黃素是調(diào)味品姜黃的主要組成成分,具有廣泛的生物活性和藥理作用,如抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗增殖等,為許多疾病提供有效的治療方法。但是姜黃素抑制或延緩糖尿病相關(guān)的腎臟炎癥反應(yīng)和足細(xì)胞EMT的分子機(jī)制仍不明確。依據(jù)以上背景,我們提出如下假說：糖尿病大鼠腎臟中cav-1或p-cav-1的改變可激活TLR4,引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng),而姜黃素治療可以通過抑制cav-1或p-cav-1與TLR4的相互作用,抑制由糖尿病引發(fā)的炎癥反應(yīng)；姜黃素通過調(diào)節(jié)cav-1與β-catenin的交叉對話抑制糖尿病條件下足細(xì)胞的EMT,從而抑制腎臟纖維化進(jìn)展。為驗(yàn)證我們的假設(shè),我們將首先檢測糖尿病大鼠腎臟中的炎癥因子、EMT、cav-1或p-cav-1的變化、TLR4以及β-catenin的變化,驗(yàn)證其在體內(nèi)存在上述改變,然后利用體外高糖刺激的足細(xì)胞模型尋找上述指標(biāo)變化的機(jī)制。研究方法為明確姜黃素對糖尿病大鼠腎組織中炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用鏈脲佐菌素(streptozoticin, STZ)一次性腹腔內(nèi)注射使糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠成模,STZ注射后給予姜黃素100mg-kg-1·d-1灌胃。治療12周后,稱重、抽血、留尿、取腎,進(jìn)而檢測各個指標(biāo)。體外實(shí)驗(yàn)小鼠永生化足細(xì)胞系給予姜黃素(1,5,10μ.M)預(yù)刺激1h后,給予高糖刺激72h。實(shí)驗(yàn)室方法檢測大鼠空腹血糖、24h尿蛋白定量、腎重/體重和內(nèi)生肌酐清除率；PAS、masson染色以及FN、Collagen Ⅰ的免疫組織化學(xué)染色評估大鼠腎小球纖維化情況；采用免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠腎臟中ED-1、MCP-1、TLR4的表達(dá)；用ELISA法檢測腎組織和足細(xì)胞中IL-6、TNFα的蛋白表達(dá)水平；實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測腎臟和足細(xì)胞中IL-6、TNFα、IL-1p和TLR4的基因表達(dá)水平；western blot方法檢測大鼠腎臟組織和足細(xì)胞中p-cav-1、cav-1、TLR4的蛋白表達(dá)。為了驗(yàn)證TLR4與炎癥因子之間的關(guān)系,我們引進(jìn)TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)足細(xì)胞,實(shí)時熒.光定量RT-PCR和ELISA法分別檢測高糖刺激的足細(xì)胞中IL-6、TNFa的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步研究p-cav-1的作用,我們引進(jìn)cav-1 Tyr14磷酸化位點(diǎn)突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)足細(xì)胞,western blot方法檢測足細(xì)胞中p-cav-1、cav-1、TLR4的表達(dá),并用ELISA法檢測足細(xì)胞中IL-6、TNFα的蛋白表達(dá)水平。為明確姜黃素對糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞EMT的作用和機(jī)制研究,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用STZ一次性腹腔注射使糖尿病大鼠成模,STZ注射后給予姜黃素100mg·kg-1·d-1灌胃。治療12周后,稱重、抽血、留尿、取腎,進(jìn)而檢測各個指標(biāo)。體外實(shí)驗(yàn)小鼠永生化足細(xì)胞系給予姜黃素(1,5,10μm)預(yù)刺激1h后,給予高糖刺激72h。實(shí)驗(yàn)室方法檢測大鼠空腹血糖、24h尿蛋白定量、腎重/體重和內(nèi)生肌酐清除率；PAS、masson染色方法評估大鼠腎小球的纖維化情況；電鏡檢測足細(xì)胞足突的融合情況；western blot、免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時熒光定量RT-PCR方法檢測大鼠腎臟組織或足細(xì)胞中FSP-1、a-SMA、P-cadherin、synaptopodin的蛋白和基因表達(dá)；western blot、免疫組織化學(xué)染色方法檢測大鼠腎臟組織或足細(xì)胞中p-cav-1、cav-1、ictive β-catenin、β-catenin的表達(dá)。采用免疫共沉淀方法檢測cav-1與β-catenin之間相互作用；采用免疫熒光技術(shù)檢測cav-1與β-catenin之間的定位改變。研究結(jié)果1.姜黃素通過抑制p-cav-1誘導(dǎo)的TLR4激活而抑制糖尿病大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)1.1姜黃素改善糖尿病大鼠代謝指標(biāo)較DM組相比,姜黃素治療后空腹血糖無明顯改善,24h尿蛋白定量以及腎重/體重均明顯下降,內(nèi)生肌酐清除率明顯增加。1.2姜黃素改善腎小球纖維化等腎臟病理的異常PAS染色顯示姜黃素治療組大鼠腎臟系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積較DM組明顯減少。Masson染色顯示糖尿病大鼠腎臟纖維化明顯,而姜黃素治療明顯改善腎臟纖維化程度。免疫組織化學(xué)的染色結(jié)果表明姜黃素治療組大鼠腎組織中FN和Collagen I的蛋白表達(dá)較DM組明顯減少。1.3姜黃素對糖尿病大鼠腎臟巨噬細(xì)胞的浸潤及MCP-1表達(dá)的影響DM組大鼠腎臟中ED-1(ED-1表示巨噬細(xì)胞)的浸潤較正常對照組明顯增加,但姜黃素治療后明顯減少。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示姜黃素干預(yù)糖尿病大鼠后其腎組織中MCP-1的表達(dá)較DM組明顯減少。1.4姜黃素抑制糖尿病大鼠腎組織中炎癥因子的表達(dá)實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素治療組大鼠腎臟組織中IL-6、TNFα、IL-1β的基因表達(dá)較DM組明顯下降。ELISA檢測結(jié)果顯示姜黃素治療組大鼠腎臟組織中IL-6和TNFa的蛋白表達(dá)較DM組明顯地下降。1.5姜黃素治療糖尿病大鼠腎臟中cav-1與TLR4的變化免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時熒光定量RT-PCR和western blot均發(fā)現(xiàn)較正常對照組,糖尿病組大鼠腎組織中TLR4表達(dá)明顯升高,而姜黃素治療后明顯減少大鼠腎臟中TLR4的表達(dá)。同時western blot結(jié)果顯示姜黃素治療組大鼠腎臟中p-cav-1的表達(dá)較DM組明顯地下降。1.6姜黃素減少高糖刺激的足細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素治療組足細(xì)胞中1L-6、TNFα、IL-1p的基因表達(dá)較HG組明顯下降。ELISA檢測結(jié)果顯示姜黃素治療組足細(xì)胞中IL-6和TNFα的蛋白表達(dá)較HG組明顯下降。單純姜黃素和滲透壓并不影響炎癥因子的表達(dá)。1.7 TLR4對高糖刺激的足細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的作用TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染后使足細(xì)胞內(nèi)源性TLR4的蛋白表達(dá)減少60%,基因水平減少72%。單純TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,對內(nèi)源性IL-6、TNFα的蛋白和基因表達(dá)均無明顯影響,但可明顯減少高糖誘導(dǎo)的IL-6和TNFα的升高。1.8姜黃素通過調(diào)節(jié)p-cav-1抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中TLR4的激活與正常組比較,在高糖狀態(tài)下TLR4的表達(dá)明顯增加,同時高糖能明顯誘導(dǎo)cav-1 Tyr14位點(diǎn)的磷酸化。而姜黃素(1,5,10μM)預(yù)刺激能明顯減少高糖誘導(dǎo)的TLR4和p-cav-1的增加。較空質(zhì)粒組,GFP-cav-1 Y14F明顯減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中p-cav-1TLR4、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)。2.姜黃素通過調(diào)控cav-1改善糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化2.1姜黃素改善糖尿病大鼠代謝指標(biāo)和腎臟病理較DM組相比,姜黃素治療后空腹血糖無明顯改善,24h尿蛋白定量以及腎重/體重均明顯下降,內(nèi)生肌酐清除率明顯地上升。PAS染色顯示姜黃素治療組大鼠腎臟系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)沉積較DM組明顯減少。Masson染色顯示糖尿病大鼠腎臟纖維化明顯,而姜黃素治療明顯改善腎臟纖維化程度。電鏡結(jié)果顯示與正常對照組比較,DM組大鼠腎臟基底膜增厚,足突出現(xiàn)融合,而姜黃素治療后可明顯改善DM組大鼠腎臟的這些形態(tài)學(xué)的損傷。2.2姜黃素改善DM大鼠腎臟EMT指標(biāo)免疫組化、Western blot和RT-PCR均發(fā)現(xiàn)較正常對照組,DM組P-cadherin, synaptopodin的蛋白和基因表達(dá)均明顯下降,FSP、α-SMA、snail1的表達(dá)明顯增加,而姜黃素治療后均能改善上述指標(biāo)的變化。2.3姜黃素對糖尿病大鼠腎臟p-cav-1指標(biāo)的影響Western blot結(jié)果顯示較正常對照組,DM組p-cav-1、active β-catenin、 P-catenin水平明顯增加。免疫組織化學(xué)染色顯示cav-1的表達(dá)在各組間無明顯差異,而P-catenin在DM組大鼠腎臟中的表達(dá)要高于正常組。姜黃素治療12周后,與正常組大鼠比較,DM組大鼠腎臟中p-cav-1、active β-catenin、β-catenin的表達(dá)明顯減少。2.4高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT及姜黃素抑制足細(xì)胞EMT作用Western blot和實(shí)時熒光定量RT-PCR結(jié)果均顯示P-cadherin和synaptopodin較對照組以時間依賴性地減少,而FSP-1、α-SMA較對照組以時間依賴性地增加。姜黃素(1,5,10μM)干預(yù)明顯抑制高糖誘導(dǎo)的P-cadherin、synaptopodin、FSP-1和α-SMA的蛋白和基因改變。2.5姜黃素通過調(diào)節(jié)p-cav-1和增加cav-1和β-catenin的穩(wěn)固聯(lián)系而抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT與對照組比較,高糖明顯增加足細(xì)胞中p-cav-1、active β-catenin、β-catenin的表達(dá),而姜黃素(1,5,10μM)預(yù)刺激明顯改善高糖誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的變化。免疫共沉淀結(jié)果顯示高糖刺激72h后,cav-1和β-catenin免疫共沉淀明顯減少,而姜黃素(10μM)干預(yù)后cav-1和β-catenin免疫共沉淀增加。熒光顯微鏡觀察到高糖使cav-1和β-catenin在細(xì)胞膜的共定位減少,而姜黃素干預(yù)后使cav-1和β-catenin在細(xì)胞膜的共定位明顯增加。結(jié)論1.姜黃素預(yù)處理可以減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟病理損傷,保護(hù)足細(xì)胞,減少尿蛋白,改善腎功能,延緩DN的進(jìn)展。2.姜黃素可改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟和高糖刺激的足細(xì)胞中炎癥反應(yīng)和EMT改變,減少糖尿病大鼠腎臟中巨噬細(xì)胞的浸潤及腎小球的纖維化。3.姜黃素改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟和高糖刺激的足細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的作用與抑制TLR4的激活有關(guān)。高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞中cav-1的磷酸化及TLR4的表達(dá)增加。姜黃素可能通過抑制p-cav-1誘導(dǎo)的TLR4的激活來發(fā)揮抗炎效果,抑制巨噬細(xì)胞浸潤,下調(diào)炎癥因子的表達(dá)。4.姜黃素防治DN的作用機(jī)制還與抑制足細(xì)胞EMT有關(guān)。高糖刺激以時間依賴地促進(jìn)足細(xì)胞EMT的發(fā)生,而姜黃素可以劑量依賴的減輕足細(xì)胞EMT。姜黃素可能是通過減少高糖誘導(dǎo)的p-cav-1的產(chǎn)生及增加cav-1與β-catenin的穩(wěn)定性來抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9
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本文編號：2210249