發(fā)布時間：2020-11-06 08:20

　　 肢體缺血再灌注(LIR)在臨床外科中較常見,如動脈損傷或栓塞后再通、斷肢再植、肢體創(chuàng)傷及止血帶的長時間應(yīng)用等；特別是在地震災(zāi)難中,肢體缺血損傷的致殘率與致死率非常高,值得關(guān)注。挽救缺血肢體的關(guān)鍵是盡快恢復(fù)血液循環(huán),大量研究證明,LIR不僅影響局部缺血組織的存活和功能,還可造成全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),并可能導(dǎo)致遠(yuǎn)隔多臟器功能衰竭(MODS)。其中,肺臟是回流靜脈血進(jìn)入的第一個臟器,靜脈血中的有害物質(zhì)最先作用于肺臟,肺臟是最易受損的器官之一,易造成急性肺損傷(ALI)。對于LIR繼發(fā)性遠(yuǎn)隔器官損傷的機(jī)制目前尚不完全清楚；近年來人們對LIR致ALI的機(jī)制研究多集中在損傷與氧化應(yīng)激方面,認(rèn)為造成此種損傷的中心環(huán)節(jié)是大量活性氧(ROS)的產(chǎn)生及其引發(fā)一系列的中性粒細(xì)胞激活、炎癥介質(zhì)生成及蛋白酶類增多等連鎖反應(yīng)。遠(yuǎn)隔器官的損傷類似LIR損傷,即再灌注期重于缺血期,且損傷程度與缺血時間相關(guān)。研究結(jié)果認(rèn)為,在正常溫度下,骨骼肌是肢體最易缺血的組織,僅可耐受缺血4h。凋亡、壞死被認(rèn)為是缺血再灌注(I/R)組織細(xì)胞的病理結(jié)局。隨著研究的深入,認(rèn)為自噬能夠被各種損傷及氧化應(yīng)激等誘發(fā)。1977年,Hourdry等首次在即將死亡的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了自噬現(xiàn)象,并提出自噬可能促進(jìn)細(xì)胞存活的假說。自噬與凋亡的關(guān)系是生命科學(xué)研究的一個熱點,但有關(guān)ALI與自噬方面的相關(guān)研究甚少。近年來,大部分研究證實了自噬不但對缺乏營養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞起保護(hù)性作用,而且可以促進(jìn)細(xì)胞存活。另外還發(fā)現(xiàn),在一定條件下,抑制自噬可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡,而上調(diào)自噬則可以阻止細(xì)胞凋亡的起始。自噬作為新的程序性細(xì)胞死亡的方式,在I/R中的作用越來越得到重視,自噬體的形成是自噬發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。自噬體形成與自噬相關(guān)基因有關(guān)(autophagy associated gene, ATG),現(xiàn)在有很多方法可以檢測自噬的活性,其中免疫印跡(western blot)法檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain3, LC3)的表達(dá)情況最為常用。LC3蛋白I/II和Beclin-1是兩個重要的自噬相關(guān)分子,被廣泛地用來研究自噬的發(fā)生和發(fā)展。LC3-II被認(rèn)為是自噬性細(xì)胞死亡的特異性分子標(biāo)志物,含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比。在肺血管細(xì)胞中,炎性標(biāo)志物高表達(dá)引發(fā)自噬,LC3-II轉(zhuǎn)化增加并聚集,自噬量進(jìn)一步增加,從而引起肺支氣管上皮細(xì)胞死亡及組織損傷。烏司他丁(ulinastatin, UTI)是從人尿中提取精制成的糖蛋白,是一種廣譜的酶抑制劑,UTI降解形成的低分子產(chǎn)物仍對酶有高效抑制作用。UTI可抑制多種水解酶活性,穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜的生理功能；UTI可抑制過度的炎癥反應(yīng),改善循環(huán)器官灌注、保護(hù)組織器官功能。臨床上,UTI最早被用于重癥急性胰腺炎的治療,現(xiàn)在還廣泛應(yīng)用于治療SIR、MODS及ALI/ARDS,其具有改善肺氣體交換,防止肺功能惡化功能。各種損傷及氧化應(yīng)激等可誘發(fā)細(xì)胞自噬,而上調(diào)自噬可阻止細(xì)胞凋亡的起始。自噬溶酶體多為酸性水解酶,推測UTI可抑制自噬溶酶體,達(dá)到干預(yù)過度自噬,從而對LIR所導(dǎo)致的ALI具有保護(hù)效應(yīng)。本研究旨在建立大鼠LIR致ALI模型,觀察LIR不同再灌注時間對自噬活性的影響,研究自噬在LIR致ALI中的作用,觀察UTI有效干預(yù)LIR細(xì)胞過度自噬提供依據(jù),為減少LIR所致遠(yuǎn)隔組織器官損傷提供有效的治療靶點。第一部分大鼠肢體缺血再灌注急性肺損傷細(xì)胞自噬及其相關(guān)蛋白的表達(dá)目的：研究大鼠雙下肢缺血再灌注所致急性肺損傷(LIR-ALI)肺組織細(xì)胞早期自噬及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。方法：1.采用大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h制備LIR-ALI模型。12只雄性SD大鼠,隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(Sham)組,肢體缺血3h再灌注4h(I/R)組,每組6只。稱質(zhì)量后大鼠3%戊巴比妥鈉(首劑40mg/kg,維持劑量20mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于動物手術(shù)臺上。Sham組僅雙側(cè)股三角處切開皮膚,分離出股動脈,絲線標(biāo)記不結(jié)扎,縫合創(chuàng)口。I/R組分離出股動脈后,于近腹股溝韌帶處用無創(chuàng)微動脈夾夾閉股動脈使雙下肢缺血,縫合創(chuàng)口再以適度松緊的橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎雙下肢根部以防側(cè)枝循環(huán),以捫不到足背動脈搏動、雙足變暗變涼為缺血成功的標(biāo)志；3h后打開原切口,去除動脈夾恢復(fù)雙下肢血流再灌注4h,動脈搏動恢復(fù)及雙足逐漸變紅變暖為建立LIR模型成功。2.再灌注4h末即刻剖開胸腔,直視下經(jīng)心尖部穿刺抽取3～4ml全血,采用ELISA檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH),并放血處死大鼠。3.取雙肺組織,4℃的冰0.9%NaCl溶液浸泡,肺變白后取下左肺放置于4%的多聚甲醛固定24 h以上,石蠟包埋后切片行免疫熒光染色測量,在倒置熒光顯微鏡下由�？漆t(yī)師閱片,觀察肺組織免疫熒光特異性標(biāo)記抗體的表達(dá),并利用Image J2x軟件進(jìn)行免疫熒光強(qiáng)度分析。4.利用RT-PCR法檢測各組肺組織Beclinl和Atg5 mRNA表達(dá)：取右側(cè)肺組織100 mg,采用Trizol試劑盒抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,然后采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。5. Western blot法檢測LC3蛋白表達(dá)：取下剩余右側(cè)肺組織100 mg,-80℃保存,蛋白免疫印記(Western blot)測量肺組織LC3蛋白含量,將膠片進(jìn)行掃描或拍照,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析條帶凈光密度值,并計算LC3-II/GAPDH的蛋白含量比值。結(jié)果：1.大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)測：Sham組(2.35±0.03)×103U/L, I/R組(6.66+0.08)×103U/L,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=119.242,P=0.000；P0.01);I/R組血清LDH的活性顯著升高,提示大鼠LIR模型制備成功。間接表明本方法建立的LIR模型,能夠有效造成ALI。2.免疫熒光染色鏡下Sham組可見正常肺組織且結(jié)構(gòu)清晰,而I/R組中肺組織結(jié)構(gòu)紊亂且肺泡壁增厚；免疫熒光強(qiáng)度值Sham組(5.54±0.23),I/R組(9.58+0.50),兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.979,P=0.000；P0.01)；I/R組的肺組織免疫熒光特異性標(biāo)記抗體高表達(dá)。3.肺組織Beclin 1和Atg5 mRNA相對定量表達(dá)：I/R組與Sham組Beclin1和Atg5 mRNA2-△△CT比值分別為12.79、18.36,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.01)。4. Western blot法檢測LC3-I蛋白含量凈光密度值Sham組1699.65±50.85,I/R組6707.37±104.45,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=105.590,P=0.000；P0.01)；LC3-II蛋白含量凈光密度值Sham組5783.73±130.55,I/R組12961.46±500.96,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-33.962,P=0.000：P0.01)；GAPDH蛋白含量凈光密度值Sham組7631.27±111.61,I/R組7531.82±21.19,兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.144, P=0.081; P0.01); LC3-II/GAPDH比值,Sham組0.76±0.02,I/R組1.72±0.07,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論：1.建立的LIR模型,能夠有效造成ALI,LIR-ALI建模成功。2.大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h引起了肺組織免疫熒光染色特異性標(biāo)記抗體的高表達(dá)；3.半定量RT-PCR法測定Beclin1和Atg5 mRNA相對表達(dá)量亦增高,促進(jìn)了自噬的激活；而LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/GAPDH均顯著增高,LIR-ALI導(dǎo)致肺組織自噬上調(diào)�？傊�,大鼠LIR-ALI后激活肺組織細(xì)胞自噬及其相關(guān)蛋白高表達(dá)。第二部分烏司他丁對大鼠肢體缺血再灌注急性肺損傷細(xì)胞自噬的影響目的：探討烏司他丁對大鼠雙下肢缺血再灌注導(dǎo)致急性肺損傷(LIR-ALI)肺組織細(xì)胞自噬的保護(hù)效應(yīng)。方法：采用前述方法制備肢體缺血3h再分別灌注0,2,4,8h的LIR-ALI模型,72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)+生理鹽水(SO+NS)組,肢體缺血再灌注+生理鹽水(I/R+NS)組,肢體缺血再灌注+烏司他丁(I/R+UTI)組,每組再分4亞組,每亞組各6只。各時點末于大鼠左側(cè)頸內(nèi)靜脈分別注射NS或UTI5×104U/kg各1ml,按前述方法步驟,15min后采用ELISA法檢測血LDH和免疫熒光法檢測肺組織病理變化,利用RT-PCR法檢測各組肺組織Beclinl和Atg5mRNA表達(dá)及Western blot法檢測LC3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：1.免疫熒光染色鏡下I/R+NS組0、2、4h時點可見肺組織結(jié)構(gòu)紊亂且肺泡間隔有增厚,8h時點肺泡腔明顯縮小甚至出現(xiàn)實變現(xiàn)象；SO+NS及I/R+UTI兩組中上述病理現(xiàn)象減輕。2.采用2-△△CT法分析肺組織Beclinl和Atg5 mRNA相對表達(dá)量SO+NS組中不同時點均無明顯變化(P0.05); I/R+NS組中4,8h時點與0時點比較明顯增高(P0.01或P0.05),4時點最高(P0.01),與SO+NS組中各相同時點比較均有明顯增高(P0.01),亦以4h時點為甚(P0.01)；I/R+UTI組中4h時點與0時點比較明顯增高(P0.01),與SO+NS組中各相同時點比較均有明顯增高(P0.01或P0.05),與I/R+NS組比較4h時點降低最明顯(P0.01)。3. Western blot法檢測LC3-II蛋白含量及LC3-Ⅱ/GAPDH值SO+NS組中2,4,8h時點與0時點比較均明顯增高(P0.01); I/R+NS組中4,8h時點與0時點比較明顯增高(P0.01),但LC3-Ⅱ/GAPDH值2時點有所下降(P0.01),與SO+NS組中各相同時點比較均有明顯增高(P0.01); I/R+UTI組中4,8h時點與0時點比較均明顯增高(P0.01),且與I/R+NS組比較各相同時點均有明顯降低(P0.01)。結(jié)論：1.建立的LIR-ALI模型可重復(fù)有效復(fù)制。2.大鼠雙下肢缺血3h再分別灌注0,2,4,8h引起了肺組織免疫熒光染色特異性標(biāo)記抗體的高表達(dá)；半定量RT-PCR法測定Beclin 1和Atg5 mRNA相對表達(dá)量亦增高,肺組織細(xì)胞自噬上調(diào),自噬的激活以4h時點為高峰期,8h時點稍下降；Western blot法檢測LC3-II蛋白含量4,8h時點高表達(dá),自噬泡的數(shù)量4h時點亦最多。3.UTI靜脈注射使得Beclin 1和Atg5 mRNA相對表達(dá)量降低,自噬下調(diào),并使得LC3-II蛋白含量減少,說明UTI可抑制大鼠LIR-ALI自噬的發(fā)生與發(fā)展；另外,自噬的激活與自噬泡的數(shù)量均以4h時點為甚,應(yīng)早期阻斷LIR并給予UTI干預(yù)性治療,且以4h內(nèi)為佳�？傊�,烏司他丁可下調(diào)大鼠雙下肢LIR-ALI肺組織細(xì)胞自噬過表達(dá),具有良好的保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R614
【部分圖文】：

ｂＨｈｉ＾Ｈ??ｍｍｍａｍ??圖１－３：兩組大鼠的肺組織免疫焚光圖??Ｆｉｇ．?１－３：?Ｔｈｅ?ｉｍｍｕｎｏ打ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｐｉｃｔｕｒｅ?ｉｎ?ｌｕｎｇ?ｔｉｓｓｕｅ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｉｎ?ｔｗｏ?ｇｒｏｕｐｓ??兩組Ａ、Ｂ圖為原色巧光，藍(lán)色代表染細(xì)胞核，綠色代表染特異性標(biāo)記抗體，??Ｃ圖為Ｍｅｒｇｅ圖０２００倍）；??２３??

（１）大鼠血清乳酸脫氨酶化ＤＨ）測定：Ｉ／Ｒ各組血清ＬＤＨ的活性均顯著??升高（戶均＝０．０００，於０．０１），所有組合的交互效應(yīng)顯著（護(hù)＝１２６２．８９５，?７＾０．０１?），??同樣地，間接證實大鼠ＬＩＲ－ＡＬＩ模型制備成功（見表２－１，圖２－２）。??４８??

ｂＨｈｉ＾Ｈ??ｍｍｍａｍ??圖１－３：兩組大鼠的肺組織免疫焚光圖??Ｆｉｇ．?１－３：?Ｔｈｅ?ｉｍｍｕｎｏ打ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｐｉｃｔｕｒｅ?ｉｎ?ｌｕｎｇ?ｔｉｓｓｕｅ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｉｎ?ｔｗｏ?ｇｒｏｕｐｓ??兩組Ａ、Ｂ圖為原色巧光，藍(lán)色代表染細(xì)胞核，綠色代表染特異性標(biāo)記抗體，??Ｃ圖為Ｍｅｒｇｅ圖０２００倍）；??２３??

本文編號：2872892