發(fā)布時(shí)間：2020-11-05 00:05

　　 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程非常復(fù)雜,機(jī)體中部分組織細(xì)胞受到致癌因素的影響,在基因水平失去正常調(diào)控生長(zhǎng)的能力,發(fā)生異常増生致癌變。目前,外科手術(shù)仍然是治療惡性腫瘤的最常用的方法。原發(fā)腫瘤切除后,局部腫瘤復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移治療效果差。轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是惡性腫瘤患者死亡的最主要原因。術(shù)中無(wú)法完全避免癌細(xì)胞的播散、入血,麻醉及手術(shù)影響新陳代謝、神經(jīng)分泌因子,引起感染及免疫應(yīng)激,進(jìn)而影響著惡性腫瘤術(shù)后的轉(zhuǎn)歸。乳腺癌,目前當(dāng)之無(wú)愧為女性最�；嫉膼盒阅[瘤之一,在女性患者中發(fā)病率已躍居第一,死亡率也僅僅低于位居第一的肺癌。隨著近些年來(lái)人們生活方式變化以及生存與生態(tài)環(huán)境的不斷惡化,每年新增乳腺癌病例高達(dá)3-4%的,且越來(lái)越呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。近年來(lái),隨著圍手術(shù)期醫(yī)學(xué)得到越來(lái)越多的重視,麻醉藥物及方式與惡性腫瘤術(shù)中及術(shù)后的關(guān)系及影響逐漸成為新的熱點(diǎn)及關(guān)注對(duì)象。研究顯示,不同麻醉方案的實(shí)施可影響惡性腫瘤微環(huán)境,從而影響其發(fā)展。最新的研究提示,麻醉藥物亦可直接作用于惡性腫瘤病灶,研究涉及到氟烷、硫噴妥鈉、丙泊酚等少數(shù)麻醉藥物,而其他的全麻藥物及局麻藥物對(duì)惡性腫瘤轉(zhuǎn)歸的影響研究較少。因?yàn)槭禽^新的研究領(lǐng)域,各家尚存在爭(zhēng)論。自古以來(lái),科學(xué)總是在破與立中向前發(fā)展的,惡性腫瘤目前依然是醫(yī)學(xué)界乃至生命科學(xué)的難題,希望麻醉對(duì)于惡性腫瘤的影響的研究可以為惡性腫瘤的防治添磚加瓦。本實(shí)驗(yàn)選用的局麻藥羅哌卡因(ropivacaine,RP),(S)-N-(2,6-二甲基苯基)-1-丙基-2哌啶羧酰胺,為純左旋(S)-對(duì)映異構(gòu)體,是臨床工作中在椎管內(nèi)麻醉及周圍神經(jīng)阻滯中最常選取的局麻藥�，F(xiàn)有的研究顯示,局麻藥對(duì)于惡性腫瘤病人的預(yù)后有積極的影響,而國(guó)內(nèi)對(duì)羅哌卡因在抗腫瘤方面的研究還很少,局麻藥尚存在諸多未被發(fā)現(xiàn)的有益之處,等待我們對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。目的本研究首先觀察羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙的影響,進(jìn)而又建立了人乳腺癌MCF-7細(xì)胞移植瘤模型,觀察羅哌卡因作用下乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)、形態(tài)學(xué)變化以及在分子水平影響,最后觀察了臨床手術(shù)麻醉中使用羅哌卡因后對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響,為臨床手術(shù)麻醉中選擇對(duì)乳腺癌患者更適合的麻醉方式及藥物提供新的科學(xué)依據(jù)。本研究共分以下三個(gè)部分。第一部分羅哌卡因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙的影響方法1.MTT法檢測(cè)不同濃度的羅哌卡因(100μg/ml、200μg/ml及400μg/ml)孵育人乳腺癌MCF-7細(xì)胞12h后,對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響,對(duì)照組用等量的生理鹽水。2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響。3.微管示蹤法觀察不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后對(duì)乳腺癌細(xì)胞有絲分裂的影響。4.Hoechst 33258單染及Hoechst 33258/PI雙染法檢測(cè)不同濃度的羅哌卡因(同上)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡與死亡的影響。5.Transwell小室法測(cè)定不同濃度的羅哌卡因(同上)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響。6.Western blotting法檢測(cè)不同濃度的羅哌卡因(同上)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞MMP-2蛋白與MMP-9蛋白的表達(dá)的影響,進(jìn)而研究對(duì)其侵襲能力的影響。7.細(xì)胞劃痕法檢測(cè)不同濃度的羅哌卡因(同上)處理后對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移的影響。8.微絲與線粒體示蹤法觀察不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后對(duì)乳腺癌細(xì)胞微絲變化及線粒體數(shù)量的影響。結(jié)果1.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(100μg/ml、200μg/ml及400μg/ml)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用(P0.05)。2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,乳腺癌細(xì)胞處于分裂期或?yàn)榉至哑谧鰷?zhǔn)備的時(shí)期減少,而處于靜止期的細(xì)胞明顯增多,并與羅哌卡因的濃度有關(guān)(P0.05)。3.微管示蹤法顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,細(xì)胞有絲分裂相減少,并與羅哌卡因的濃度有關(guān),濃度越高有絲分裂相的減少越明顯(P0.05)。4.Hoechst 33258單染及Hoechst 33258/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,細(xì)胞的凋亡率升高,細(xì)胞的死亡率也升高,并隨羅哌卡因濃度升高而升高(P0.05)。5.Transwell小室法檢測(cè)顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,乳腺癌細(xì)胞穿過(guò)小室底部微孔濾膜背面每視野的細(xì)胞數(shù)明顯降低,減少程度與羅哌卡因濃度有關(guān)(P0.05)。6.Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,細(xì)胞MMP-2蛋白及MMP-9蛋白表達(dá)量隨羅哌卡因的濃度升高而降低(P0.05)。7.細(xì)胞劃痕法檢測(cè)顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,相對(duì)愈合距離隨羅哌卡因濃度的升高而逐漸降低(P0.05)。8.微絲與線粒體示蹤法觀察顯示,不同濃度的羅哌卡因(同上)作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,隨著羅哌卡因濃度的提高,微絲與線粒體的形態(tài)學(xué)改變朝著不利于腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向發(fā)展。第二部分羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦龅挠绊懛椒?.以30只BALB/c-nu裸鼠建立人MCF-7乳腺癌移植瘤模型,最終選取24只腫瘤最小徑在2 mmb10 mm范圍內(nèi)的裸鼠納入研究,隨機(jī)分為2組即對(duì)照組C’組、羅哌卡因處理組R’組,C’組在腫瘤周圍注射生理鹽水,1ml/次,R’組在腫瘤周圍注射2mg/ml羅哌卡因1ml/次,1次/d,連續(xù)15d。以后每隔三天測(cè)量腫瘤大小,給藥終止一天后結(jié)束測(cè)量,計(jì)算各組腫瘤體積,并取得平均值。給藥終止一天后處死各組裸鼠,選用頸椎脫位法。頸椎脫位法處死裸鼠后可完整的剖出人乳腺癌MCF-7細(xì)胞移植瘤組織,并量出最終腫瘤大小,后將其進(jìn)行固定、包埋,也可放置于-80℃冰箱中保存待用。2.對(duì)移植瘤的體積進(jìn)行測(cè)量,繪制生長(zhǎng)曲線,觀察羅哌卡因?qū)σ浦擦錾�長(zhǎng)的影響。3.蘇木素-伊紅(H.E)染色法,觀察羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦鲂螒B(tài)學(xué)的影響。4.免疫組織化學(xué)染色法,觀察羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦錾掀?間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)的影響。5.免疫熒光法,觀察羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦錾掀?間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響。6.Western blot檢測(cè)羅哌卡因?qū)θ橄侔┮浦擦鯰GF-β、VEGF、MMP-9表達(dá)的影響。結(jié)果1.測(cè)量移植瘤體積,繪制生長(zhǎng)曲線顯示,R’組較C’組乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)明顯緩慢(P0.05)。2.蘇木素-伊紅(H.E)染色法,觀察發(fā)現(xiàn)R’病理學(xué)改變向惡性程度減低方向發(fā)展。3.免疫組織化學(xué)染色法觀察顯示,R’組E-鈣粘素呈強(qiáng)表達(dá),波形蛋白表達(dá)較弱,HIF-1α表達(dá)較弱。4.免疫熒光法觀察顯示,R’組E-鈣粘素表達(dá)較強(qiáng),波形蛋白表達(dá)較弱。5.Western blot檢測(cè)顯示,與C’組相比,R’組乳腺癌移植瘤TGF-β、VEGF、MMP-9的表達(dá)顯著減弱(p0.05)。第三部分羅哌卡因局部浸潤(rùn)麻醉聯(lián)合胸肌神經(jīng)阻滯及切口持續(xù)浸潤(rùn)鎮(zhèn)痛對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響方法1.68例接受乳腺癌根治術(shù)的患者,隨機(jī)分為兩組,常規(guī)組(G組)和實(shí)驗(yàn)組(E組),各包括34例患者。G組采用喉罩全憑靜脈麻醉及自控靜脈鎮(zhèn)痛(PCIA),E組采用羅哌卡因局部浸潤(rùn)麻醉聯(lián)合胸肌神經(jīng)阻滯復(fù)合喉罩全憑靜脈麻醉及切口持續(xù)浸潤(rùn)鎮(zhèn)痛。在手術(shù)前(T_0)、手術(shù)開(kāi)始時(shí)(T_1)、手術(shù)1.5h時(shí)(T_2)、手術(shù)結(jié)束時(shí)(T_3)及術(shù)后3天(T_4)4個(gè)時(shí)間點(diǎn),抽取每位患者6ml靜脈血,獲取全血與血漿分別置于EDTA管中,后保存于-80℃冰箱。2.兩組患者均在T_0、T_1、T_2、T_3及T_4時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用高效液相層析法測(cè)定PRL、GH、IL-8、皮質(zhì)醇(Cor)的水平,獲知機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)變化。3.兩組患者均在T_0、T_1、T_2、T_3及T_4時(shí)間點(diǎn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞型(CD_3~+、CD_4~+和CD_8~+)及NK細(xì)胞,比較CD_3~+T淋巴細(xì)胞百分比和CD_4~+/CD_8~+比值,揭示患者免疫功能變化。4.兩組患者均采用ELISA法檢測(cè)T_0、T_1、T_2、T_3及T_4時(shí)間點(diǎn)VEGF-C和TGF-β的變化。5.術(shù)后記錄兩組患者腫瘤大小,是否接受化療、放療及內(nèi)分泌治療,計(jì)算諾丁漢預(yù)后指數(shù)(NPI)。兩組患者均隨訪36個(gè)月,并記錄復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及接受治療情況。結(jié)果1.腫瘤大小、分級(jí)及預(yù)后因素兩組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。兩組均在諾丁漢預(yù)后指數(shù)評(píng)分中間范圍內(nèi)。此外,初始手術(shù)治療后化療,放射治療和內(nèi)分泌治療的發(fā)生率在兩組之間沒(méi)有顯著差異(p0.05)2.兩組PRL T_0最低,T_1最高、T_2-T_4逐漸降低,E組明顯低于G組(p0.05);GH在T_1-T_2逐漸升高,T_3-T_4逐漸降低,且E組明顯低于G組(p0.05);IL-8在T_1-T_4逐漸降低,且E組明顯低于G組(p0.05);Cor在T_1-T_2逐漸升高,T_3-T_4逐漸降低,且E組明顯低于G組(p0.05)。3.T_0時(shí)G組和E組的靜脈血中的CD_3~+T淋巴細(xì)胞百分比無(wú)顯著性差別。T_1時(shí)G組的CD_3~+T淋巴細(xì)胞百分比明顯低于E組(p0.05)。T_2、T_3時(shí)間點(diǎn)G組的CD_3~+T淋巴細(xì)胞百分比低于E組(p0.05)。T_4時(shí)間點(diǎn)時(shí)G組和E組的CD_3~+T淋巴細(xì)胞百分比均有不同程度的上升,但仍低于術(shù)前水平。E組CD_3~+T淋巴細(xì)胞百分比仍高于G組(p0.05)。兩組CD_4~+/CD_8~+比值在術(shù)前無(wú)明顯差異,在T_1時(shí)兩組CD_4~+/CD_8~+比值均顯著降低(p0.05),且G組下降程度更甚于E組(p0.05)。T_2、T_3時(shí)間點(diǎn)CD_4~+/CD_8~+比值明顯下降,但E組比值仍高于G組(p0.05)。T_4時(shí)間點(diǎn)CD_4~+/CD_8~+比值明顯下降,但E組比值仍高于G組(p0.05)。同時(shí),各組CD_4~+/CD_8~+比值在T_4時(shí)間點(diǎn)有不同程度的上升,但仍低于術(shù)前水平。此外,E組CD_4~+/CD_8~+比值仍高于G組(p0.05)。NK細(xì)胞在T_0-T_4無(wú)顯著變化,組間比較T_3-T_4時(shí)E組明顯高于G組(p0.05)。4.兩組患者VEGF-C、TGF-β比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。5.隨訪結(jié)果顯示E組共2位患者(6%)復(fù)發(fā),24個(gè)月與36個(gè)月無(wú)復(fù)發(fā)生存率均為94%;G組共復(fù)發(fā)8位患者(24%),24個(gè)月無(wú)復(fù)發(fā)生存率82%,36個(gè)月無(wú)復(fù)發(fā)生存率76%。兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。使用Kaplan-Meier進(jìn)行分析,E組的復(fù)發(fā)時(shí)間較慢(p0.05)。結(jié)論1、羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞增殖、侵襲及遷徙有抑制作用,對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用。2、羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)有抑制作用,并可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生,降低HIF-1α、TGF-β、VEGF及MMP-9的表達(dá)。3、羅哌卡因局部浸潤(rùn)麻醉聯(lián)合胸肌神經(jīng)阻滯及切口持續(xù)浸潤(rùn)鎮(zhèn)痛能夠減少應(yīng)激反應(yīng)、改善免疫抑制、在36個(gè)月的隨訪期間將復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)降低了四倍。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R614;R737.9
【部分圖文】：

圖 1-1 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細(xì)胞增活力的影響（*P<0.0**P<0.01 與對(duì)照組比較）.2 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細(xì)胞細(xì)胞周期的影響人乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為惡性腫瘤細(xì)胞其增殖是比較旺盛的。對(duì)照組

羅哌卡因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙的影響16圖1-2 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響（*P<0.05，**P<0.01與對(duì)照組比較）2.1.3 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細(xì)胞有絲分裂的影響人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞分別于對(duì)照組（C 組）、羅哌卡因 100μg/ml(R1 組)、羅哌卡因 200μg/ml 組(R2 組)、羅哌卡因 400μg/ml 組(R3 組)以不同濃度羅哌卡因處理后，加入微管示蹤劑，染色，并以 DAPI 復(fù)染，在顯微鏡下觀察細(xì)胞變化，結(jié)果顯示：隨著羅哌卡因濃度的不斷升高，R1、R2、R3 組細(xì)胞的有絲分裂相較對(duì)照組逐漸減少差異明顯，MCF-7 細(xì)胞有絲分裂相的減少與羅哌卡因的濃度有關(guān)，濃度越高有絲分裂相的減少越明顯（見(jiàn)圖 1-3）。圖 1-3 不同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細(xì)胞有絲分裂的影響

同濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響（*P<與對(duì)照組比較）濃度的羅哌卡因?qū)θ巳橄侔?MCF-7 細(xì)胞有絲分裂的影響癌 MCF-7 細(xì)胞分別于對(duì)照組（C 組）、羅哌卡因 100μg/00μg/ml 組(R2 組)、羅哌卡因 400μg/ml 組(R3 組)以不同濃入微管示蹤劑，染色，并以 DAPI 復(fù)染，在顯微鏡下觀隨著羅哌卡因濃度的不斷升高，R1、R2、R3 組細(xì)胞的有減少差異明顯，MCF-7 細(xì)胞有絲分裂相的減少與羅哌卡高有絲分裂相的減少越明顯（見(jiàn)圖 1-3）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2870809