發(fā)布時間：2020-10-30 13:38

　　 背景和目的蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一種高病死率和持久性的全球健康難題。雖然誘發(fā)SAH的因素有多種,但腦動脈瘤破裂引發(fā)的SAH占SAH總數(shù)的75%-85%。SAH出血后,可能引起患者出現(xiàn)嗜睡、混亂、局灶性神經(jīng)功能缺損、偏癱,甚至昏迷等,嚴重威脅患者健康和生活質(zhì)量。從病理機制方面研究SAH并發(fā)癥的發(fā)生機制,將有益于SAH病發(fā)后患者的治療和預后。SAH發(fā)生后引起機體神經(jīng)功能缺損往往誘發(fā)一些大腦病理機制的發(fā)生,如腦積水、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞凋亡、大腦水腫、血腦屏障消失、大腦調(diào)節(jié)機制異常、血栓形成等等。其中腦水腫和腦積水的發(fā)生對神經(jīng)功能損傷造成了深遠的影響。在腦水腫和腦積水發(fā)生過程中,水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)的作用至關重要。AQP1和AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的兩種水通道蛋白。已有研究表明AQP1或者AQP4與腫瘤性腦水腫、腦創(chuàng)傷、中風及AQP4基因敲除引發(fā)腦積水有一定關聯(lián)性。但已有的研究表明,AQPs的表達可能在腦積水的形成過程中起到一種反饋和代償機制,且大多都是基于AQP4基因敲除大鼠或者先天性腦積水、誘發(fā)的腦積水模型進行研究而得出的結論。而基于正常小鼠(未進行AQP1、AQP4基因敲除)SAH后水通道蛋白的動態(tài)變化以及水通道蛋白與腦積水關系,國內(nèi)外目前無相關報道;而且亦少有文獻報道SAH引起腦水腫的病理生理與水通道蛋白的關系。另外,在各種生理或者病理生理條件下,AQP1和AQP4蛋白水平的變化是可以被調(diào)控的。雖然證據(jù)指出多種機制參與AQP1和AQP4表達水平的調(diào)控過程,但具體的調(diào)節(jié)機制尚未完全明確。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)包括ERK1和ERK2,是屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路中的一個通路,其磷酸化活化狀態(tài)在調(diào)控腦損傷、星形膠質(zhì)細胞膨脹、腦血屏障損傷等過程中發(fā)揮重要作用。而且,在其它神經(jīng)細胞中,ERK1/2信號通路的激活與AQP1或者AQP4的表達存在一定關系。然而,ERK1/2調(diào)控AQP1或者AQP4是否參與SAH引發(fā)腦水腫的過程尚未可知。因此,本課題將通過建立正常小鼠的SAH模型,探討腦水腫和腦積水形成過程中,AQP1和AQP4的動態(tài)表達變化。并通過阻斷ERK1/2信號通路,探討ERK1/2對AQP1、AQP4表達的調(diào)控及其對SAH并發(fā)性病理狀態(tài)的影響。第一部分AQP4和AQP1在蛛網(wǎng)膜下腔出血后急性期腦水腫中的作用材料與方法1.實驗分組及模型建立:體質(zhì)量為28-32 g的雄性健康昆明小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、假手術組和SAH手術組(SAH組),SAH組又分為術后8h、16h、24h和3d四個亞組。采用自體血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型,正常對照組小鼠經(jīng)相同的手術過程,但未作任何處理;假手術組小鼠也經(jīng)相同的手術過程,但不注入自體血,而是注入等滲生理鹽水。2.檢測指標及方法:每組各8只小鼠麻醉醒后,對其進行神經(jīng)功能評分,然后利用干濕法測定小鼠腦組織水含量;通過伊文思藍(EB)溶液對每組各8只小鼠血腦屏障的通透性進行血腦屏障通透性測定;在每組各8只小鼠額部腦皮質(zhì)和額角脈絡叢、矢狀竇處提取標本,通過熒光定量PCR和Western Blot檢測腦皮質(zhì)和室周中AQP4表達以及脈絡叢和室周中AQP1表達。3.統(tǒng)計分析:采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±SD的形式表示。組間比較用單因素方差分析,各組均數(shù)間比較采用q檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.與Sham組相比,SAH急性期術后不同時間點(8h、16h、24h和3d)組小鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能受損,且在術后8 h時受損最嚴重,隨著時間的延長,神經(jīng)功能逐漸恢復,但仍低于Sham組;SAH小鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性在術后不同時間點(8h、16h、24h和3d)均較Sham組顯著升高(P0.05),且在術后24h達到峰值,術后3 d較術后24 h相比,腦組織含水量和血腦屏障通透性均下降。2.Real-time PCR和western blot結果顯示SAH急性期術后不同時間點(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠皮質(zhì)和室周AQP4 m RNA和蛋白表達水平分別較Sham組小鼠上調(diào),且術后8 h、16 h和24 h小鼠皮質(zhì)和室周AQP4表達量逐漸升高,在術后24 h達到峰值,術后3 d較術后24 h相比,皮質(zhì)和室周AQP4表達量均下調(diào)。3.Real-time PCR結果顯示SAH急性期術后不同時間點(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠脈絡叢AQP1 m RNA表達水平較Sham組下調(diào),術后8 h、16 h和24 h脈絡叢AQP1 m RNA表達量逐漸下調(diào),在術后24 h降至最低值,術后3 d較術后24 h相比,脈絡叢AQP1 m RNA表達量上調(diào);western blot結果提示術后8 h、16 h和24 h小鼠脈絡叢AQP1蛋白表達較Sham組略有下降。SAH術后不同時間點(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠室周AQP1 m RNA和蛋白表達量較Sham組均上調(diào),且隨著時間的增加,于術后24 h達到最高峰,術后3 d較術后24 h小鼠相比,室周AQP1表達下調(diào)。第二部分AQP4和AQP1在蛛網(wǎng)膜下腔出血后慢性期腦積水中的作用材料與方法1.實驗分組及模型建立:將SAH小鼠分為無腦積水組和腦積水組,兩組小鼠又進一步細分為術后1周、2周和4周各3個亞組。采用自體血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型。2.檢測指標及方法:每組各8只小鼠麻醉醒后,對其進行神經(jīng)功能評分,并利用干濕法測定小鼠腦組織水含量;通過EB溶液對每組各8只小鼠血腦屏障的通透性進行血腦屏障通透性測定;在每組各8只小鼠額部腦皮質(zhì)和額角脈絡叢、矢狀竇處提取標本,通過熒光定量PCR和Western Blot檢測腦皮質(zhì)和室周中AQP4表達以及脈絡叢和室周中AQP1表達。3.統(tǒng)計分析:采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±SD的形式表示。組間比較用單因素方差分析,各組均數(shù)間比較采用q檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.SAH慢性期術后不同時間點(1周、2周和4周)相比,無腦積水組和腦積水組小鼠神經(jīng)功能均無統(tǒng)計學差異(P0.05),隨著時間的增加,無腦積水組小鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性沒有變化,而腦積水組腦組織含水量和血腦屏障通透性均逐漸增加;腦積水組與非腦積水組相比,不同時間點(1周、2周和4周)小鼠神經(jīng)功能均顯著下降(P0.05)而腦含水量均顯著升高(P0.05),術后1周兩組小鼠血腦屏障通透性無顯著差異(P0.05),術后2周和4周腦積水組小鼠血腦屏障通透性較非腦積水組顯著增加(P0.05)。2.Real-time PCR結果顯示無腦積水組小鼠室周和皮質(zhì)AQP4 m RNA表達在SAH慢性期術后不同時間點(1周、2周和4周)無差異,而腦積水組隨著術后時間的增加,AQP4 m RNA表達逐漸上調(diào);腦積水組與非腦積水組相比,術后1周小鼠室周和皮質(zhì)AQP4 m RNA表達無顯著差異(P0.05),術后2周和4周表達均顯著增加(P0.05)。Western blot結果顯示術后1周和2周,小鼠室周AQP4蛋白表達在腦積水組與非腦積水組中均無差異,而皮質(zhì)AQP4蛋白表達在腦積水組中略有下降,術后4周,小鼠室周和皮質(zhì)AQP4蛋白在腦積水組中較非腦積水組中均顯著上調(diào)(P0.05)。3.Real-time PCR結果顯示無腦積水組小鼠脈絡叢和室周AQP1 m RNA表達在SAH術后不同時間點(1周、2周和4周)的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),而腦積水組中,隨著術后時間的增加AQP1 m RNA表達也增加;腦積水組與非腦積水組相比,術后1周和2周時,小鼠脈絡叢和室周AQP1 m RNA表達下調(diào),術后4周AQP1 m RNA表達顯著上調(diào)(P0.05)。Western blot結果顯示術后1周腦積水組小鼠脈絡叢和室周AQP1蛋白表達較無腦積水組均下調(diào),脈絡叢AQP1蛋白在術后2周和4周表達無差異,室周區(qū)域在術后2周表達無差異,術后4周在腦積水組表達上調(diào)。第三部分AQP4和AQP1在蛛網(wǎng)膜下腔出血后不同程度腦積水中的作用材料與方法1.實驗分組及模型建立:將SAH術后4周的小鼠根據(jù)核磁共振(MRI)結果分為輕度、中度、重度腦積水組。采用自體血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型。同等數(shù)量的無腦積水SAH小鼠為對照。2.檢測指標及方法:MRI檢測腦室大小及腦積水的程度;每組各8只小鼠麻醉醒后,對其進行神經(jīng)功能評分,及利用干濕法測定小鼠腦組織水含量;通過EB溶液對每組各8只小鼠血腦屏障的通透性進行血腦屏障通透性測定;在每組各8只小鼠額部腦皮質(zhì)和額角脈絡叢、矢狀竇處提取標本,通過熒光定量PCR和Western Blot檢測腦皮質(zhì)和室周中AQP4表達以及脈絡叢和室周中AQP1表達。3.統(tǒng)計分析:采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±SD的形式表示。組間比較用單因素方差分析,各組均數(shù)間比較采用q檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.根據(jù)小鼠側(cè)腦室/腦組織寬度比值將SAH腦積水小鼠分為輕度、中度和重度三個組。與對照組相比,SAH不同程度腦積水小鼠神經(jīng)功能均顯著下降(P0.05)、腦含水量和血腦屏障通透性均顯著增加(P0.05),且隨著腦積水嚴重程度的增加,神經(jīng)功能逐漸下降、腦含水量和血腦屏障通透性逐漸上升。2.Real-time PCR和western blot結果顯示SAH不同程度腦積水組與對照組相比,小鼠室周和皮質(zhì)AQP4 m RNA和蛋白表達水平均上調(diào),且隨著腦積水嚴重程度的增加,AQP4 m RNA和蛋白表達逐漸增加。3.Real-time PCR和western blot結果顯示SAH不同程度腦積水組與對照組相比,小鼠脈絡叢和室周AQP1 m RNA和蛋白表達水平均上調(diào),且隨著腦積水嚴重程度的增加,AQP1 m RNA和蛋白表達逐漸增加。第四部分AQP4和AQP1在蛛網(wǎng)膜下腔出血后急性期的可能機制材料和方法1.實驗分組:小鼠分為假手術組、SAH+U0126組和SAH+vehicle組。SAH+U0126組是于SAH處理后腦池注射ERK通路阻斷劑U0126(U0126溶于0.1%DMSO中,并以0.20μg/Kg體質(zhì)量對小鼠進行腦池注射),于SAH后8 h,16 h,24 h連續(xù)給藥,并于SAH后3 d對小鼠進行神經(jīng)行為學評分、腦含水量、血腦屏障和相關蛋白等進行檢測。SAH+vehicle組小鼠處理時間與SAH+U0126組相同,只是注射0.1%DMSO(溶于生理鹽水)。2.檢測指標及方法:每組各8只小鼠麻醉醒后,對其進行神經(jīng)功能評分,并利用干濕法測定小鼠腦組織水含量;通過EB溶液對每組各8只小鼠血腦屏障的通透性進行血腦屏障通透性測定;Western Blot檢測每組各8只小鼠室周中ERK、AQP1、AQP4的表達。3.統(tǒng)計分析:采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±SD的形式表示。組間比較用單因素方差分析,各組均數(shù)間比較采用q檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.Western blot結果顯示小鼠室周p ERK蛋白表達在SAH術后不同時間點(8h、16h、24h和3d)較Sham組均顯著上調(diào)(P0.05),且隨著術后時間的增加,于術后24h達到表達最高峰,術后3d與24h相比,室周區(qū)域p ERK蛋白表達下調(diào)。Peason相關性分析顯示SAH術后小鼠室周p ERK分別和AQP1及AQP4蛋白表達呈顯著正相關(r=0.384,P0.05;r=0.749,P0.05)。2.Western blot結果顯示,SAH組小鼠室周p ERK、AQP1和AQP4蛋白較未注射組小鼠均顯著增加(P0.05),SAH小鼠術后8h、16h和24h連續(xù)腦池注射ERK抑制劑U0126后,室周AQP1和AQP4蛋白表達顯著降低(P0.05)。3.與Sham組相比,SAH組小鼠神經(jīng)功能顯著下降(P0.05)、血腦屏障通透性和腦組織含水量均顯著增加(P0.05),SAH小鼠術后8h、16h和24h連續(xù)腦池注射ERK抑制劑U0126后,神經(jīng)功能顯著上升(P0.05)、血腦屏障通透性和腦組織含水量均顯著降低(P0.05)。結論1.枕大池二次注血法建立SAH模型小鼠,SAH急性期(術后8h、16h、24h和3d)均出現(xiàn)腦損傷,且在術后24h損傷最嚴重;SAH慢性期(術后1周、2周和4周)腦積水組小鼠較無腦積水組腦損傷嚴重,腦積水小鼠在SAH術后4周損傷最嚴重。2.SAH急性期小鼠在術后24h時皮質(zhì)和室周AQP4表達水平最高,脈絡叢和室周AQP1表達水平在術后24h時分別最低和最高;SAH慢性期腦積水小鼠較無腦積水小鼠室周和皮質(zhì)AQP4表達從術后2周開始上調(diào),脈絡叢和室周AQP1表達從術后4周開始上調(diào);SAH小鼠AQP4和AQP1表達隨著腦積水嚴重程度的增加而增加。3.SAH急性期小鼠室周p ERK蛋白表達分別與AQP1和AQP4蛋白表達呈顯著正相關。ERK抑制劑U0126可顯著下調(diào)SAH小鼠室周AQP1和AQP4蛋白的表達。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R743.35
【部分圖文】：

蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）急性期不同時間點小鼠神經(jīng)行為學評分

2 蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）急性期不同時間點小鼠腦組織含水量照組；Sham：假手術組；SAH 組分為 4 組，分別為術后 8h、16h每組各 8 只小鼠。* 與 sham 組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義 蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）急性期不同時間點小鼠血腦屏障通透性術組；SAH 組分為 4 組，分別為術后 8h、16h、24h、3d。每組各與 sham 組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

網(wǎng)膜下腔出血（SAH）急性期不同時間點小鼠腦組織含；Sham：假手術組；SAH 組分為 4 組，分別為術后 8h 8 只小鼠。* 與 sham 組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計學
【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Aquaporins as potential drug targets[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年04期

本文編號：2862546