背景:腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點。缺血性腦卒中占腦卒中絕大多數(shù),所占比例約87%。腦卒中是全球60歲以上人口第二位死亡原因和15～59歲人口第五位死亡原因,在我國腦卒中已經(jīng)成為城市第三位和農(nóng)村人口第二位死亡原因。目前我國腦卒中患者約750萬,其中450萬致殘,喪失勞動能力或基本生活自理能力;每年新發(fā)病例250萬,我國缺血性腦卒中發(fā)病率仍以每年8.7%的速率上升。腦卒中嚴(yán)重危害人類健康,造成患者及其家庭和國家嚴(yán)重的醫(yī)療、經(jīng)濟和社會負(fù)擔(dān),我國每年腦卒中造成的經(jīng)濟損失高達(dá)400億元,是其他心血管疾病的10倍。缺血性腦卒中的發(fā)病機制極其復(fù)雜,與能量耗竭、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮(NO)、鈣超載、細(xì)胞凋亡、炎癥等密切相關(guān)。缺血性腦卒中臨床治療方法是溶栓,美國FDA批準(zhǔn)的唯一溶栓藥物是組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,t PA),治療時間窗僅為腦卒中發(fā)病后4.5小時,因此絕大多數(shù)患者得不到有效救治。幾十年來全球醫(yī)生和科學(xué)家們一直致力于神經(jīng)保護藥物的研究,雖然這些藥物在實驗室研究中取得了巨大進展,但是在后期的臨床試驗中都失敗了。尋找治療缺血性腦卒中的新策略和新藥物是腦卒中研究的熱點和難點。缺血性腦卒中發(fā)生時,缺血缺氧可促進機體發(fā)生代償性血管新生,但過程緩慢,作用很弱。通過給予藥物促進腦缺血局部血管新生,建立新的循環(huán)通路以有效緩解缺血引起的神經(jīng)損傷,并對神經(jīng)再生及神經(jīng)功能恢復(fù)產(chǎn)生治療作用,這種方法就是治療性血管新生,治療性血管新生有望成為臨床治療缺血性腦卒中的新策略。我室前期研究報道血管內(nèi)皮細(xì)胞存在α7 n ACh R,參與血管新生調(diào)節(jié),其激動劑膽堿,能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度,促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖及體外血管索形成,促進心梗組織側(cè)枝循環(huán)的建立。提出α7 n ACh R可能是治療心腦血管缺血性疾病的新靶標(biāo)。膽堿是否可以促進腦血管新生從而提供腦保護以治療缺血性腦卒中有待研究。本研究以永久性局灶性腦缺血大鼠和低氧誘導(dǎo)下大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,觀察膽堿對缺血性腦卒中的治療作用及其血管新生相關(guān)機制。方法:1.動物實驗分組與給藥方法雄性SD大鼠(體重280±20g)隨機分為8組,每組18只,包括假手術(shù)組、膽堿50 mg/kg組、膽堿100 mg/kg組、膽堿200 mg/kg組、膽堿100 mg/kg+α7 n ACh R選擇性阻斷劑MLA1 mg/kg組、MLA 1 mg/kg組和陽性對照藥尼莫地平20 mg/kg組。模型組和各給藥組大鼠采用線栓法誘導(dǎo)右側(cè)大腦中動脈永久性局灶性腦缺血,假手術(shù)組僅做血管分離,不插管,其余操作同手術(shù)組。所有藥物用注射用水溶解,膽堿和尼莫地平口服給藥,MLA采用皮下給藥,給藥量2 m L/kg,于手術(shù)后4 h給藥,以后每天一次,連續(xù)給藥10天。2.動物實驗檢測指標(biāo)測定144只大鼠10天的生存率和體重;應(yīng)用Bederson評分評估神經(jīng)功能缺損;應(yīng)用雙前肢抓握實驗和平衡木實驗測定大鼠的行為學(xué)能力;p MCAO后10 d大鼠麻醉處死后迅速取腦,大腦冠狀位切片應(yīng)用TTC染色測定腦梗死體積;梗死側(cè)大腦拍照后測定腦表面血管長度和面積用于觀察缺血腦表面血管新生情況;腦石蠟切片HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)改變;切片經(jīng)CD34免疫組化及CD34/PCNA免疫熒光染色觀察大鼠缺血腦皮質(zhì)微血管新生情況;測定血清NO和VEGF水平;Real-time PCR和Western blot檢測缺血腦皮質(zhì)α7n ACh R,HIF-1α,e NOS,i NOS和VEGF基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。3.大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定取3周齡大鼠腦用改良膠原酶/分散酶消化法培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。簡單的說,將2～3周齡大鼠腦皮質(zhì)剪碎、勻漿,然后先后通過200μm和77μm的濾網(wǎng)過濾,濾網(wǎng)上組織應(yīng)用0.1%膠原酶/分散酶37°C消化25 min,沉淀中加入25%BSA-DMEM中1000×g,梯度離心20 min分離微血管層。分離的微血管加入完全DMEM培養(yǎng)基于37°培養(yǎng)于5%CO2培養(yǎng)箱中,完全培養(yǎng)基成分包括:20%FBS,100μg/m L內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,100μg/m L肝素鈉,3.75 mg/m L HEPS,0.2 U/m L胰島素,0.3 mg/m L L-谷氨酰胺,10U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素,p H 7.2–7.4。細(xì)胞應(yīng)用CD34抗體免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定陽性,第三代細(xì)胞用于實驗研究。4.細(xì)胞實驗檢測指標(biāo)在低氧(1%O2、95%CO2)培養(yǎng)條件下,運用小干擾RNA技術(shù)(small-interfering-RNA,si RNA)沉默HIF-1α基因,應(yīng)用MTS試劑盒檢測膽堿對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用;應(yīng)用劃痕實驗檢測膽堿對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用;應(yīng)用Matrigel基質(zhì)膠使內(nèi)皮細(xì)胞形成血管索,檢測膽堿對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管作用影響;應(yīng)用NO生化試劑盒和VEGF ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液NO和VEGF水平。細(xì)胞實驗分組:對照組(無膽堿DMEM);膽堿1μM組;膽堿10μM組;膽堿100μM;膽堿100μM+MLA 1μM組;MLA 1μM組;膽堿10μM+HIF-1αsi RNA 100 nmol/L組。5.統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件,各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用Bonferroni’s檢驗,P0.05作為差異有顯著性。結(jié)果:第一部分膽堿對大鼠局灶性腦缺血的治療作用及其血管新生機制1.膽堿增加p MCAO大鼠生存率,改善體重和神經(jīng)功能大鼠p MCAO后10天,與假手術(shù)組相比,大鼠生存率降到60%。膽堿50～200 mg/kg給藥10天,提高生存率到67%～80%,但是α7 n ACh R選擇性阻斷劑MLA 1 mg/kg能夠阻斷膽堿100 mg/kg的作用。大鼠p MCAO后10天,體重明顯減輕,給予膽堿治療后體重明顯增加。應(yīng)用Bederson評分連續(xù)10天評定大鼠神經(jīng)功能缺損,模型組Bederson評分顯著增加,100和200 mg/kg膽堿給藥7～10天明顯改善神經(jīng)功能缺損;應(yīng)用雙側(cè)前肢抓握和平衡木行走實驗評定大鼠前肢肌力和感覺運動反射和協(xié)調(diào)能力,膽堿治療可以劑量依賴性提高大鼠肌力,但是膽堿對大鼠平衡木行走實驗評分沒有顯著改變;膽堿的這些作用能夠被MLA所阻斷。2.膽堿減少p MCAO大鼠腦梗死體積和神經(jīng)細(xì)胞死亡大鼠p MCAO后10天,腦梗死體積明顯增加;膽堿治療10天,能夠劑量依賴性降低腦梗死體積;但是膽堿的作用能夠被MLA所完全阻斷;在腦切片HE染色圖像中,模型組大鼠可見許多死亡的神經(jīng)細(xì)胞,同時伴有核固縮、腫脹和空泡化;膽堿能夠顯著改善這些病理學(xué)改變;MLA能夠阻斷膽堿的作用。3.膽堿促進缺血腦組織血管新生大鼠p MCAO后10天,檢測膽堿對腦缺血表面和腦缺血組織半影區(qū)血管新生情況。與假手術(shù)組相比,模型組腦表面血管數(shù)量明顯增加,膽堿能夠劑量依賴性地促進p MCAO大鼠腦缺血組織血管新生,總的血管長度和血管面積與模型組相比顯著性增加。CD34/PCNA免疫熒光雙染顯示新增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞,代表微血管密度。與模型組相比,膽堿100mg/kg和200 mg/kg組CD34和PCNA共表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯增加。MLA能夠完全阻斷膽堿對p MCAO大鼠缺血腦組織促血管新生作用。CD34免疫組化結(jié)果與之一致。尼莫地平和膽堿作用不一致,不能夠促進缺血腦組織血管新生。4.膽堿提高p MCAO大鼠血清NO和VEGF水平pMCAO后10天,測定大鼠血清NO和VEGF水平。與假手術(shù)組比較,模型組血清NO水平明顯降低,但是VEGF水平?jīng)]有明顯改變。100～200 mg/kg膽堿給藥10天均能顯著增加血清NO和VEGF的水平,這一作用能夠被MLA所阻斷。尼莫地平增加NO水平,但對VEGF水平?jīng)]有明顯影響。5.膽堿對p MCAO大鼠缺血腦皮質(zhì)相關(guān)基因和蛋白的影響大鼠p MCAO后10天,應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測缺血腦皮質(zhì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平。與假手術(shù)組相比,模型組α7 n ACh R、HIF-1α和VEGF m RNA水平明顯上調(diào),然而e NOS m RNA顯著下調(diào),i NOS m RNA沒有明顯改變。100 mg/kg治療10天顯著增加α7n ACh R、HIF-1α、e NOS和VEGF m RNA水平,但是對i NOS基因沒有明顯改變。1 mg/kg MLA能夠阻斷膽堿的上述作用,但是其本身沒有直接作用。各組α7 n ACh R、HIF-1α、e NOS、i NOS和VEGF蛋白表達(dá)水平結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果基本上一致。第二部分膽堿對低氧條件下r BMECs的影響1.膽堿促進r BMECs增殖、遷移和小管形成在1%的低氧條件下孵育24 h,與對照組相比,1～100μM膽堿能夠濃度依賴性地促進r BMECs增殖,細(xì)胞遷移和血管索形成;1μM MLA和100 nmol/L HIF-1αsi RNA能夠阻斷10μM膽堿的上述作用,并且不產(chǎn)生直接作用,提示膽堿是通過激活α7 n ACh R上調(diào)HIF-1α表達(dá)促進r BMECs增殖、遷移和小管形成。2.膽堿增加r BMECs培養(yǎng)液中NO和VEGF水平低氧條件下,給藥24 h后測定r BMECs培養(yǎng)上清液中NO和VEGF水平。與對照組相比,1～100μM膽堿能夠濃度依賴性地提高NO和VEGF水平。MLA能夠阻斷膽堿促r BMECs分泌NO和VEGF;HIF-1αsi RNA能夠阻斷膽堿促r BMECs分泌VEGF但是對NO分泌無明顯影響。提示膽堿促進r BMECs分泌VEGF與激活α7 n ACh R和HIF-1α同時相關(guān);而促進NO分泌僅與激活α7 n ACh R相關(guān)。結(jié)論:1.膽堿通過激活α7 n ACh R促進p MCAO大鼠缺血腦組織血管新生,形成側(cè)枝循環(huán),從而提高大鼠生存率,減少腦梗死體積,改善體重和神經(jīng)行為學(xué)功能。2.膽堿治療大鼠缺血性腦卒中的血管新生作用與上調(diào)腦組織α7 n ACh R,HIF-1α,e NOS和VEGF m RNA和蛋白表達(dá),提高血清VEGF和NO水平有關(guān)。3.膽堿在低氧誘導(dǎo)下通過激活α7 n ACh R促進r BMECs增殖、遷移、成管作用和分泌VEGF、NO,可能是其促缺血性腦血管新生的細(xì)胞學(xué)機制。4.激活α7 nAChR通路促進腦血管新生可能是缺血性腦卒中治療的新途徑。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R96
【文章目錄】：縮略詞表
中文摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 膽堿對大鼠局灶性腦缺血的治療作用及其血管新生機制
前言
技術(shù)路線圖
材料與方法
1 實驗材料
1.1 實驗動物
1.2 主要試劑和設(shè)備
2 實驗方法
2.1 線栓法制備大鼠永久性局灶性腦缺血模型
2.2 分組及給藥
2.3 大鼠生存率測定
2.4 大鼠體重測定
2.5 神經(jīng)功能及行為學(xué)評定
2.6 組織取材及處理
2.7 腦表面血管密度測定
2.8 TTC染色測定腦梗死體積
2.9 病理學(xué)染色
2.10 血清NO水平測定
2.11 血清VEGF水平測定
2.12 Realtime PCR
2.13 Western blot
2.14 統(tǒng)計學(xué)分析
實驗結(jié)果
1 膽堿對大鼠局灶性腦缺血的治療作用
1.1 膽堿對pMCAO大鼠生存率的影響
1.2 膽堿對大鼠體重的影響
1.3 膽堿對大鼠神經(jīng)功能及行為學(xué)評定的影響
2 膽堿對大鼠腦損傷病理學(xué)的影響
2.1 膽堿對pMCAO大鼠腦梗死體積的影響
2.2 膽堿對pMCAO大鼠缺血腦皮質(zhì)病理形態(tài)學(xué)影響
3 膽堿對pMCAO大鼠的腦血管新生作用
3.1 膽堿對pMCAO大鼠腦表面血管密度的影響
3.2 膽堿對pMCAO大鼠缺血腦皮質(zhì)血管新生的影響
4 膽堿對pMCAO大鼠腦血管新生相關(guān)作用機制
4.1 膽堿對pMCAO大鼠血清NO的影響
4.2 膽堿對pMCAO大鼠血清VEGF的影響
5 膽堿對pMCAO大鼠缺血腦皮質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響
5.1 膽堿對 α7 nAChR mRNA表達(dá)的影響
5.2 膽堿對HIF-1α mRNA表達(dá)的影響
5.3 膽堿對eNOS mRNA表達(dá)的影響
5.4 膽堿對iNOS mRNA表達(dá)的影響
5.5 膽堿對VEGF mRNA表達(dá)的影響
6 膽堿對pMCAO大鼠缺血腦組織相關(guān)蛋白水平的影響
6.1 膽堿對 α7 nAChR蛋白表達(dá)的影響
6.2 膽堿對HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響
6.3 膽堿對eNOS蛋白表達(dá)的影響
6.4 膽堿對iNOS蛋白表達(dá)的影響
6.5 膽堿對VEGF蛋白表達(dá)的影響
附圖
結(jié)語
第二部分 膽堿對低氧誘導(dǎo)下大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
前言
技術(shù)路線圖
材料與方法
1 實驗材料
1.1 實驗動物
1.2 主要試劑和設(shè)備
2 實驗方法
2.1 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定
2.2 siRNA實驗
2.3 MTS實驗
2.4 劃痕實驗
2.5 血管索形成實驗
2.6 rBMECs培養(yǎng)上清NO，VEGF測定
2.7 統(tǒng)計學(xué)分析
實驗結(jié)果
1 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rBMECs）原代培養(yǎng)和鑒定
2 HIF-1α siRNA對rBMECs干擾效率的檢測
3 膽堿對大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管索形成的影響
3.1 膽堿對低氧rBMECs增殖的影響
3.2 膽堿對低氧rBMECs遷移的影響
3.3 膽堿對低氧rBMECs形成血管索的影響
4 膽堿對低氧誘導(dǎo)rBMECs分泌NO, VEGF的影響
4.1 膽堿對低氧誘導(dǎo)rBMECs分泌NO的影響
4.2 膽堿對低氧誘導(dǎo)rBMEC分泌VEGF的影響
結(jié)語
全文討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論著
個人簡歷
致謝
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本文編號：
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