發(fā)布時間：2019-07-22 11:15

【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是引起豬腹瀉的重要病原之一,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重危害。本研究對PEDV分離株JS-2纖突蛋白(S)進行抗原表位分析,選擇3個富含表位片段的區(qū)域。通過RT-PCR擴增基因序列,克隆入p ET32a(+)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中并進行誘導表達,SDS-PAGE電泳顯示,成功表達了3個重組蛋白,分子質(zhì)量與預期大小一致。將蛋白進行割膠回收,與油佐劑乳化后免疫小鼠,制備超免疫血清,利用PEDV包被抗原進行ELISA檢測,結(jié)果免疫小鼠血清D450值達1.0左右,證實篩選制備的重組蛋白具有良好的免疫原性和反應原性。
【圖文】：

TheinducedcontrolofCOE；8：pET-28a（＋）圖2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2DoublerestrictiveenzymedigestionofrecombinantplasmidM：DNA分子質(zhì)量標準；1：pET32a質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；2：pET32a-S-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；3：pET32a-S2-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；4：pET32a-COE質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物M：DL10000DNAMarker；1：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a；2：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S-1；3：Dou-blerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S2-1；4：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-COE圖1PCR擴增結(jié)果Fig.1PCRproductofgeneM：DNA分子質(zhì)量標準；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）M：DL2000DNAMarker；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）2.4ELISA檢測同時檢測免前血清、一免后第7天的血清、二免后第7天的血清、三免后第7天的血清及三免后第14天的血清中的IgG抗體水平。結(jié)果見圖5所示。IgG水平隨免疫次數(shù)的增加而顯著升高，4組間差異不顯著。2.5Western-blot檢測將各蛋白的超免疫血清與其進行Western-blot檢測，結(jié)果（見圖6）發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)特異性目的條帶，證明這3個蛋白均能與其各自血清發(fā)生較好反應。3討論豬流行性腹瀉病毒廣泛存在于世界各國養(yǎng)豬場中，導致豬群發(fā)生急性、高度傳染性消化道疾玻近幾年，該病在中國廣泛蔓延，，造成嚴重經(jīng)濟損失。目前PEDV商品化疫苗保護效力在逐年降低，其中M1232000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM123410000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bpM12345678980hu60ku40ku30ku20ku12ku80hu60ku40ku30ku20ku12ku80hu60ku40ku30ku20ku12ku123M45678M906

炯觳?Fig.3SDS-PAGEanalysisexpressionproteinM：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：S1-1蛋白誘導表達前；2：S1-1蛋白誘導表達后；3：誘導空載體pET-28a（＋）；4：S2-1蛋白誘導表達前；5：S2-1蛋白誘導表達后；6：COE蛋白誘導表達前；7：COE蛋白誘導表達后；8：誘導空載體pET-28a（＋）M：ProteinMarker；1：TheuninducedcontrolofS1-1；2：TheinducedcontrolofS1-1；3：pET-28a（＋）；4：TheuninducedcontrolofS2-1；5：TheinducedcontrolofS2-1；6：TheuninducedcontrolofCOE；7：TheinducedcontrolofCOE；8：pET-28a（＋）圖2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2DoublerestrictiveenzymedigestionofrecombinantplasmidM：DNA分子質(zhì)量標準；1：pET32a質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；2：pET32a-S-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；3：pET32a-S2-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；4：pET32a-COE質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物M：DL10000DNAMarker；1：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a；2：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S-1；3：Dou-blerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S2-1；4：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-COE圖1PCR擴增結(jié)果Fig.1PCRproductofgeneM：DNA分子質(zhì)量標準；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）M：DL2000DNAMarker；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）2.4ELISA檢測同時檢測免前血清、一免后第7天的血清、二免后第7天的血清、三免后第7天的血清及三免后第14天的血清中的IgG抗體水平。結(jié)果見圖5所示。IgG水平隨免疫次數(shù)的增加而顯著升高，4組間差異不顯著。2.5Western-blot檢測將各蛋白的超免疫血清與其進行Western-blot檢測，結(jié)果（見圖6）發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)特異性目的條帶，證明這3個蛋白均能與其各?
【作者單位】： 上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所;上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院;上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室;
【基金】：滬農(nóng)科攻字(2013)第3-6項目;滬農(nóng)科攻字(2013)第5-5號項目;滬農(nóng)科產(chǎn)字(2016)第6號項目;滬農(nóng)科推字(2017)第1-11號 滬農(nóng)青2016第1-35號項目
【分類號】：S852.651

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本文編號：2517586