發(fā)布時(shí)間：2019-07-22 11:15

【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是引起豬腹瀉的重要病原之一,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重危害。本研究對(duì)PEDV分離株JS-2纖突蛋白(S)進(jìn)行抗原表位分析,選擇3個(gè)富含表位片段的區(qū)域。通過RT-PCR擴(kuò)增基因序列,克隆入p ET32a(+)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳顯示,成功表達(dá)了3個(gè)重組蛋白,分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致。將蛋白進(jìn)行割膠回收,與油佐劑乳化后免疫小鼠,制備超免疫血清,利用PEDV包被抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè),結(jié)果免疫小鼠血清D450值達(dá)1.0左右,證實(shí)篩選制備的重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。
【圖文】：

TheinducedcontrolofCOE；8：pET-28a（＋）圖2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2DoublerestrictiveenzymedigestionofrecombinantplasmidM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET32a質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；2：pET32a-S-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；3：pET32a-S2-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；4：pET32a-COE質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物M：DL10000DNAMarker；1：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a；2：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S-1；3：Dou-blerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S2-1；4：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-COE圖1PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1PCRproductofgeneM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）M：DL2000DNAMarker；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）2.4ELISA檢測(cè)同時(shí)檢測(cè)免前血清、一免后第7天的血清、二免后第7天的血清、三免后第7天的血清及三免后第14天的血清中的IgG抗體水平。結(jié)果見圖5所示。IgG水平隨免疫次數(shù)的增加而顯著升高，4組間差異不顯著。2.5Western-blot檢測(cè)將各蛋白的超免疫血清與其進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果（見圖6）發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)特異性目的條帶，證明這3個(gè)蛋白均能與其各自血清發(fā)生較好反應(yīng)。3討論豬流行性腹瀉病毒廣泛存在于世界各國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)中，導(dǎo)致豬群發(fā)生急性、高度傳染性消化道疾玻近幾年，該病在中國(guó)廣泛蔓延，，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前PEDV商品化疫苗保護(hù)效力在逐年降低，其中M1232000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM123410000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bpM12345678980hu60ku40ku30ku20ku12ku80hu60ku40ku30ku20ku12ku80hu60ku40ku30ku20ku12ku123M45678M906

炯觳?Fig.3SDS-PAGEanalysisexpressionproteinM：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：S1-1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)前；2：S1-1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后；3：誘導(dǎo)空載體pET-28a（＋）；4：S2-1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)前；5：S2-1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后；6：COE蛋白誘導(dǎo)表達(dá)前；7：COE蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后；8：誘導(dǎo)空載體pET-28a（＋）M：ProteinMarker；1：TheuninducedcontrolofS1-1；2：TheinducedcontrolofS1-1；3：pET-28a（＋）；4：TheuninducedcontrolofS2-1；5：TheinducedcontrolofS2-1；6：TheuninducedcontrolofCOE；7：TheinducedcontrolofCOE；8：pET-28a（＋）圖2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2DoublerestrictiveenzymedigestionofrecombinantplasmidM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET32a質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；2：pET32a-S-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；3：pET32a-S2-1質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；4：pET32a-COE質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物M：DL10000DNAMarker；1：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a；2：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S-1；3：Dou-blerestrictiveenzymedigestionofpET32a-S2-1；4：DoublerestrictiveenzymedigestionofpET32a-COE圖1PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1PCRproductofgeneM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）M：DL2000DNAMarker；1：S-1（1184bp）；2：S2-1（439bp）；3：COE（433bp）2.4ELISA檢測(cè)同時(shí)檢測(cè)免前血清、一免后第7天的血清、二免后第7天的血清、三免后第7天的血清及三免后第14天的血清中的IgG抗體水平。結(jié)果見圖5所示。IgG水平隨免疫次數(shù)的增加而顯著升高，4組間差異不顯著。2.5Western-blot檢測(cè)將各蛋白的超免疫血清與其進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果（見圖6）發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)特異性目的條帶，證明這3個(gè)蛋白均能與其各?
【作者單位】： 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所;上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院;上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：滬農(nóng)科攻字(2013)第3-6項(xiàng)目;滬農(nóng)科攻字(2013)第5-5號(hào)項(xiàng)目;滬農(nóng)科產(chǎn)字(2016)第6號(hào)項(xiàng)目;滬農(nóng)科推字(2017)第1-11號(hào) 滬農(nóng)青2016第1-35號(hào)項(xiàng)目
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：2517586