發(fā)布時(shí)間：2019-07-21 16:10

【摘要】：鴨坦布蘇病毒病是鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的以產(chǎn)蛋下降、生長遲緩為主要特征的鴨新發(fā)傳染病,肉鴨及蛋鴨均能感染該病。該病群內(nèi)發(fā)病率能達(dá)到100%,死淘率為5%~15%。免疫接種是預(yù)防與控制該病的關(guān)鍵性措施之一,研制安全、有效,且能夠有效區(qū)分疫苗免疫和野毒感染的新型疫苗對該病的防控至關(guān)重要。鴨坦布蘇病毒囊膜蛋白E蛋白構(gòu)成DTMUV的主要抗原表位,與病毒的吸附有關(guān),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體,引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。本研究首先構(gòu)建了表達(dá)DTMUV E蛋白的重組腺病毒疫苗,并對其免疫效果的進(jìn)行初步分析。根據(jù)鴨坦布蘇病毒AH-F10株(GenBank登錄號(hào):KM102539)的E基因序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物。提取鴨坦布蘇病毒的RNA,并擴(kuò)增目的基因。將目的基因連接至穿梭載體pacAd-CMV K-NpA中。將PCR、酶切及測序鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒用Pac I酶線性化,之后與同樣經(jīng)Pac I酶線性化的骨架載體pacAd5 9.2-100共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞,包裝出重組腺病毒rAd-E。將rAd-E感染AAV-293細(xì)胞,連續(xù)傳代,均可產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變,表明rAd-E具有良好的遺傳穩(wěn)定性。檢測第8代重組腺病毒滴度,TCID50為10-6.17/0.1mL。間接免疫熒光和Western blotting試驗(yàn)結(jié)果表明,重組腺病毒可以在體外表達(dá)E蛋白,且該表達(dá)的重組E蛋白具有良好的反應(yīng)原性。應(yīng)用構(gòu)建的表達(dá)E蛋白的重組腺病毒載體進(jìn)行了免疫保護(hù)試驗(yàn)。將7日齡健康雛鴨隨機(jī)分成4組,分別免疫重組腺病毒rAd-E,免疫劑量為108TCID50、鴨坦布蘇病毒病AH-F10株油乳滅活苗(陽性對照),免疫劑量為0.5m L、wt Ad免疫劑量為108TCID50、PBS注射0.5mL,2周后用同等劑量加強(qiáng)免疫一次。免疫前后分別對各組試驗(yàn)鴨頸靜脈采血,分離血清,進(jìn)行DTMUV特異性抗體、中和抗體檢測,同時(shí)分離外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。二次免疫后2周進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。應(yīng)用DTMUV AH-TL15野毒株攻毒所有雛鴨,攻毒劑量為0.5mL(ELD50為10-2.38/0.1mL)。記錄發(fā)病及死亡情況,并剖檢存活鴨只,制作病理切片。結(jié)果顯示,重組腺病毒rAd-E免疫雛鴨后1周可誘導(dǎo)鴨坦布蘇病毒特異性抗體的產(chǎn)生,抗體水平顯著高于PBS組和wtAd組,但低于陽性對照組;中和抗體滴度最高達(dá)到1:16,低于陽性對照組,PBS組和wtAd組均未檢測到中和抗體。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示rAd-E組的刺激指數(shù)最高,陽性對照組次之,且兩組之間差異顯著(P0.05);IL-4和IFN-γ蛋白含量也顯著高于陽性對照組,表明重組腺病毒免疫組有效地誘發(fā)了細(xì)胞免疫反應(yīng)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)和HE染色結(jié)果顯示陽性對照組雛鴨的保護(hù)率達(dá)到100%,重組腺病毒的保護(hù)率達(dá)到80%,PBS組和wtAd組雛鴨全部發(fā)病。陽性對照組和重組腺病毒組的各組織沒明顯病變,PBS組和wtAd組的肝臟空泡變性、脾臟和胰臟淋巴細(xì)胞浸潤、腦組織有血管周圍袖套,有噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象。說明重組腺病毒載體疫苗對鴨坦布蘇病毒有較好的保護(hù)作用。綜上所述,構(gòu)建的表達(dá)E蛋白的重組腺病毒rAd-E,能誘導(dǎo)健康鴨產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,且對野毒攻毒有較好保護(hù)雛鴨抵御DTMUV感染。研究結(jié)果為DTMUV感染防控及其基因工程疫苗的研究提供重要參考。
【圖文】：

腺病毒 DNA 復(fù)制的起始時(shí)間，基因組分為早期基因(E)和晚期基是腺病毒復(fù)制的必需基因，是病毒基因活動(dòng)的起始因子；E2 區(qū)與區(qū)為復(fù)制非必需區(qū)；E4 區(qū)編碼產(chǎn)物與與病毒 DNA 復(fù)制相關(guān)。晚期要是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[72]。毒的 E1、E3 和 E4 區(qū)的上游區(qū)域能夠插入外源基因而不影響病2]。如今的腺病毒載體通過改造，包裝容量大，且細(xì)胞毒性弱。動(dòng)子，能使得外源基因高效表達(dá)，而且表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后，一定的空間形態(tài)[73, 74]，因此免疫效力較高。毒作為載體有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)由于是復(fù)制缺陷性載體，，目的基因在游離狀態(tài)下表達(dá)，安全性好；(2)腺病毒結(jié)構(gòu)及特性已研究清楚，操作；(3)宿主范圍廣，可感染分裂期或非分裂期細(xì)胞和組織，且Fig. 1-2 Diagram of adenovirus structurereamstime.com/royalty-free-stock-images-structure-adenovirus-vector-diagram-morphology-as-most-commonly-cause-respiratory-illness-upper-respiratory-tract-image34731829）Fig. 1-2 Diagram of adenovirus structure圖 1- 2 腺病毒結(jié)構(gòu)示意圖

2 結(jié)果與分析組腺病毒的構(gòu)建結(jié)果E 基因的擴(kuò)增結(jié)果取鴨坦布蘇病毒 RNA，以設(shè)計(jì)的 E 基因引物進(jìn)行擴(kuò)增后。獲得到 1 條，與預(yù)期大小相符（圖 2-1），測序鑒定結(jié)果與目的序列一致。重組穿梭質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果測序正確的片段與穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMVK-NpA分別用EcoR I和B凝膠回收純化后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α中，挑單菌落提取質(zhì)粒，用EcoR I和BamH I酶切鑒定，可見2條大小分別為6200b片段，符合預(yù)期（圖 2-2），表明重組穿梭質(zhì)粒 pacAd-E 構(gòu)建成功。bpM 1bpM 1
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.32

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2517288